304 kemijska komponenta spiralne cijevi od nehrđajućeg čelika, struktura ektodomene SPACA6 sadrži očuvanu superobitelj proteina povezanih sa fuzijom gameta.

Hvala što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, web stranicu prikazujemo bez stilova i JavaScripta.
Klizači koji prikazuju tri članka po slajdu.Za pomicanje kroz slajdove koristite gumbe Natrag i Sljedeće ili gumbe za upravljanje slajdovima na kraju za kretanje kroz svaki slajd.

SPACA6 je površinski protein eksprimiran u spermi koji je kritičan za fuziju gameta tijekom spolne reprodukcije sisavaca.Unatoč ovoj temeljnoj ulozi, specifična funkcija SPACA6 je slabo shvaćena.Razjašnjavamo kristalnu strukturu izvanstanične domene SPACA6 pri rezoluciji od 2,2 Å, otkrivajući protein s dvije domene sastavljen od četverolančanog snopa i Ig-sličnih β-sendviča spojenih kvazi-fleksibilnim poveznicama.Ova struktura nalikuje IZUMO1, drugom proteinu povezanom sa fuzijom gameta, čineći SPACA6 i IZUMO1 osnivačima superobitelji proteina povezanih s oplodnjom koji se ovdje nazivaju IST superporodica.IST superobitelj je strukturno definirana svojim upletenim snopom od četiri zavojnice i parom disulfidno povezanih CXXC motiva.AlphaFold pretraga ljudskog proteoma temeljena na strukturi identificirala je dodatne proteinske članove ove superobitelji;osobito, mnogi od ovih proteina uključeni su u fuziju gameta.Struktura SPACA6 i njezin odnos s drugim članovima superobitelji IST predstavljaju kariku koja nedostaje u našem znanju o fuziji gameta sisavaca.
Svaki ljudski život počinje s dvije odvojene haploidne gamete: očevim spermijem i majčinom jajnom stanicom.Ovaj spermij pobjednik je intenzivnog selekcijskog procesa tijekom kojeg milijuni spermijskih stanica prolaze kroz ženski genitalni trakt, svladavaju razne prepreke1 i prolaze kroz kapacitaciju, što pojačava njihovu pokretljivost i proces površinskih komponenti2,3,4.Čak i ako se spermij i jajna stanica nađu, proces još nije gotov.Oocita je okružena slojem kumulusnih stanica i glikoproteinskom barijerom koja se zove zona pellucida, kroz koju spermij mora proći da bi ušao u oocitu.Spermatozoidi koriste kombinaciju molekula površinske adhezije i enzima povezanih s membranom i izlučenih enzima kako bi prevladali ove konačne barijere5.Te su molekule i enzimi uglavnom pohranjeni u unutarnjoj membrani i akrosomalnom matriksu i detektiraju se kada se vanjska membrana spermija lizira tijekom akrosomalne reakcije6.Posljednji korak u ovom intenzivnom putovanju je događaj spajanja spermija i jajašca, u kojem dvije stanice spajaju svoje membrane kako bi postale jedan diploidni organizam7.Iako je ovaj proces revolucionaran u ljudskoj reprodukciji, potrebne molekularne interakcije slabo su shvaćene.
Osim oplodnje spolnih stanica, opsežno je proučavana kemija spajanja dva lipidna dvosloja.Općenito, membranska fuzija je energetski nepovoljan proces koji zahtijeva da proteinski katalizator prođe strukturnu promjenu konformacije koja približava dvije membrane, prekidajući njihov kontinuitet i uzrokujući fuziju8,9.Ovi proteinski katalizatori poznati su kao fuzogeni i pronađeni su u bezbrojnim fuzijskim sustavima.Potrebni su za ulazak virusa u stanice domaćina (npr. gp160 u HIV-1, skok u koronavirusima, hemaglutinin u virusima influence)10,11,12 placente (sincitin)13,14,15 i fuzije koje stvaraju gamete u nižim eukariotima ( HAP2/GCS1 kod biljaka, protista i člankonožaca) 16,17,18,19.Fusogene za ljudske gamete tek treba otkriti, iako se pokazalo da je nekoliko proteina kritično za pričvršćivanje i fuziju gameta.CD9 izražen u oocitima, transmembranski protein potreban za fuziju mišjih i ljudskih gameta, bio je prvi koji je otkriven 21,22,23.Iako njegova točna funkcija ostaje nejasna, uloga u adheziji, strukturi žarišta adhezije na mikrovilima jajeta i/ili ispravnoj lokalizaciji površinskih proteina oocita čini se vjerojatnim 24,25,26.Dva najtipičnija proteina koja su kritična za spajanje gameta su protein sperme IZUMO127 i protein oocite JUNO28, a njihovo međusobno povezivanje važan je korak u prepoznavanju i adheziji gameta prije fuzije.Muški Izumo1 nokaut miševi i ženke Juno nokaut miševi potpuno su sterilni, u ovim modelima spermiji ulaze u perivitelinalni prostor, ali se gamete ne stapaju.Slično, konfluencija je bila smanjena kada su spolne stanice tretirane anti-IZUMO1 ili JUNO27,29 antitijelima u ljudskim eksperimentima in vitro oplodnje.
Nedavno je otkrivena novootkrivena skupina proteina eksprimiranih u spermiju fenotipski sličnih IZUMO1 i JUNO20,30,31,32,33,34,35.Protein 6 povezan s akrosomskom membranom spermija (SPACA6) identificiran je kao neophodan za oplodnju u velikoj studiji mutageneze kod miševa.Umetanje transgena u gen Spaca6 proizvodi netopive spermatozoide, iako ti spermiji infiltriraju perivitelinski prostor 36 .Naknadna istraživanja nokauta na miševima potvrdila su da je Spaca6 potreban za fuziju gameta 30,32.SPACA6 se izražava gotovo isključivo u testisima i ima lokalizacijski uzorak sličan onom IZUMO1, naime unutar intime spermija prije akrosomalne reakcije, a zatim migrira u ekvatorijalno područje nakon akrosomalne reakcije 30,32.Spaca6 homolozi postoje kod raznih sisavaca i drugih eukariota 30, a njegova važnost za fuziju ljudskih spolnih stanica je dokazana inhibicijom ljudske oplodnje in vitro otpornošću na SPACA6 30 .Za razliku od IZUMO1 i JUNO, detalji strukture, interakcija i funkcije SPACA6 ostaju nejasni.
Kako bismo bolje razumjeli temeljni proces na kojem se temelji spajanje ljudske sperme i jajašca, što će nam omogućiti informiranje o budućem razvoju u planiranju obitelji i liječenju plodnosti, proveli smo SPACA6 strukturne i biokemijske studije.Kristalna struktura izvanstanične domene SPACA6 pokazuje četverospiralni snop (4HB) i domenu sličnu imunoglobulinu (sličnu Ig) povezanu kvazi-fleksibilnim regijama.Kao što je predviđeno u prethodnim studijama,7,32,37 struktura domene SPACA6 slična je onoj ljudskog IZUMO1, a dva proteina dijele neobičan motiv: 4HB s trokutastom spiralnom površinom i par disulfidno povezanih CXXC motiva.Predlažemo da IZUMO1 i SPACA6 sada definiraju veću, strukturno srodnu superobitelj proteina povezanih sa fuzijom gameta.Koristeći značajke jedinstvene za superobitelji, proveli smo iscrpnu pretragu AlphaFold strukturnog ljudskog proteoma, identificirajući dodatne članove ove superobitelji, uključujući nekoliko članova koji su uključeni u spajanje gameta i/ili oplodnju.Sada se čini da postoji zajednički strukturni nabor i superobitelj proteina povezanih sa fuzijom gameta, a naša struktura pruža molekularnu kartu ovog važnog aspekta mehanizma fuzije ljudskih gameta.
SPACA6 je transmembranski protein s jednim prolazom s jednim N-povezanim glikanom i šest navodnih disulfidnih veza (slike S1a i S2).Izrazili smo izvanstaničnu domenu ljudskog SPACA6 (ostaci 27-246) u Drosophila S2 stanicama i pročistili protein pomoću afiniteta nikla, kationske izmjene i kromatografije isključenja veličine (Sl. S1b).Pročišćena ektodomena SPACA6 vrlo je stabilna i homogena.Analiza korištenjem kromatografije isključenja veličine u kombinaciji s poligonalnim raspršenjem svjetlosti (SEC-MALS) otkrila je jedan vrh s izračunatom molekularnom težinom od 26,2 ± 0,5 kDa (Sl. S1c).Ovo je u skladu s veličinom monomerne ektodomene SPACA6, što ukazuje da oligomerizacija nije nastupila tijekom pročišćavanja.Osim toga, spektroskopija kružnog dikroizma (CD) otkrila je mješovitu α/β strukturu s talištem od 51,3 °C (Sl. S1d,e).Dekonvolucija CD spektra otkrila je 38,6% α-spiralnih i 15,8% β-lančanih elemenata (Slika S1d).
Ektodomena SPACA6 kristalizirana je pomoću nasumičnog matričnog zasijavanja38 što je rezultiralo skupom podataka s rezolucijom od 2,2 Å (tablica 1 i slika S3).Korištenjem kombinacije molekularne supstitucije temeljene na fragmentima i podataka o fazama SAD-a s izloženošću bromidu za određivanje strukture (tablica 1 i slika S4), konačni pročišćeni model sastoji se od ostataka 27–246.U vrijeme kada je struktura određena, nije bilo dostupnih eksperimentalnih ili AlphaFold struktura.Ektodomena SPACA6 mjeri 20 Å × 20 Å × 85 Å, sastoji se od sedam spirala i devet β-lanaca i ima izduženi tercijarni nabor stabiliziran sa šest disulfidnih veza (Sl. 1a, b).Slaba elektronska gustoća na kraju bočnog lanca Asn243 ukazuje da je ovaj ostatak N-vezana glikozilacija.Struktura se sastoji od dvije domene: N-terminalnog snopa s četiri zavojnice (4HB) i C-terminalne domene nalik na Ig sa srednjim zglobnim područjem između njih (slika 1c).
a Struktura izvanstanične domene SPACA6.Trakasti dijagram izvanstanične domene SPACA6, boja lanca od N do C-kraja od tamnoplave do tamnocrvene.Cisteini uključeni u disulfidne veze istaknuti su magentom.b Topologija izvanstanične domene SPACA6.Koristite istu shemu boja kao na slici 1a.c SPACA6 izvanstanična domena.Dijagrami traka 4HB, šarke i Ig-like domene obojeni su narančasto, zeleno i plavo.Slojevi nisu nacrtani u mjerilu.
4HB domena SPACA6 uključuje četiri glavne spirale (heliksi 1-4), koje su raspoređene u obliku spiralne spirale (Slika 2a), naizmjenično između antiparalelnih i paralelnih interakcija (Slika 2b).Mala dodatna zavojnica s jednim zavojom (zavojnica 1′) položena je okomito na snop, tvoreći trokut sa zavojnicama 1 i 2. Taj je trokut blago deformiran u spiralno upletenom pakiranju relativno gustog pakiranja zavojnica 3 i 4 ( Slika 2a).
4HB N-terminalna traka.b Pogled odozgo na snop od četiri spirale, svaka je spirala istaknuta tamnoplavom bojom na N-kraju i tamnocrvenom bojom na C-kraju.c Spiralni dijagram kotača odozgo prema dolje za 4HB, sa svakim ostatkom prikazanim kao krug označen jednoslovnim kodom aminokiseline;numerirane su samo četiri aminokiseline na vrhu kotača.Nepolarni ostaci su obojeni žuto, polarni nenabijeni ostaci su obojeni zeleno, pozitivno nabijeni ostaci su obojeni plavo, a negativno nabijeni ostaci su obojeni crveno.d Trokutasta lica domene 4HB, s 4HB u narančastoj boji i šarkama u zelenoj boji.Oba umetka pokazuju štapićaste disulfidne veze.
4HB je koncentriran na unutarnjoj hidrofobnoj jezgri koja se uglavnom sastoji od alifatskih i aromatskih ostataka (Sl. 2c).Jezgra sadrži disulfidnu vezu između Cys41 i Cys55 koja povezuje spirale 1 i 2 zajedno u gornji podignuti trokut (slika 2d).Formirane su dvije dodatne disulfidne veze između CXXC motiva u spirali 1' i drugog CXXC motiva pronađenog na vrhu β-ukosnice u zglobnom području (Sl. 2d).Konzervativni ostatak arginina s nepoznatom funkcijom (Arg37) nalazi se unutar šupljeg trokuta kojeg tvore spirale 1′, 1 i 2. Alifatski atomi ugljika Cβ, Cγ i Cδ Arg37 međusobno djeluju s hidrofobnom jezgrom, a njegove gvanidinske skupine ciklički se kreću između spirala 1' i 1 putem interakcija između Thr32 okosnice i bočnog lanca (Sl. S5a,b).Tyr34 se proteže u šupljinu ostavljajući dvije male šupljine kroz koje Arg37 može komunicirati s otapalom.
Ig-slične β-sendvič domene velika su superobitelj proteina koji dijele zajedničku značajku dvaju ili više višelančanih amfipatskih β-ploča koje međusobno djeluju preko hidrofobne jezgre 39. C-terminalna Ig-slična domena SPACA6 ima isti obrazac a sastoji se od dva sloja (sl. S6a).List 1 je β-list od četiri niti (lanci D, F, H i I) gdje niti F, H i I tvore antiparalelni raspored, a niti I i D poprimaju paralelnu interakciju.Tablica 2 je mala antiparalelna dvolančana beta ploča (niti E i G).Uočena je unutarnja disulfidna veza između C-kraja E lanca i središta H lanca (Cys170-Cys226) (Sl. S6b).Ova disulfidna veza je analogna disulfidnoj vezi u β-sendvič domeni imunoglobulina40,41.
Četverostruki β-list se uvija cijelom svojom dužinom, tvoreći asimetrične rubove koji se razlikuju po obliku i elektrostatici.Tanji rub je ravna hidrofobna ekološka površina koja se ističe u usporedbi s preostalim neravnim i elektrostatički raznolikim površinama u SPACA6 (sl. S6b,c).Halo izloženih karbonilnih/amino skupina i polarnih bočnih lanaca okružuje hidrofobnu površinu (Sl. S6c).Širi rub prekriven je spiralnim segmentom s kapom koji blokira N-terminalni dio hidrofobne jezgre i tvori tri vodikove veze s otvorenom polarnom skupinom okosnice F lanca (Sl. S6d).C-terminalni dio ovog ruba tvori veliki džep s djelomično izloženom hidrofobnom jezgrom.Džep je okružen pozitivnim nabojem zbog tri seta dvostrukih argininskih ostataka (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 i Arg212-Arg214) i središnjeg histidina (His220) (Slika S6e).
Zglobno područje je kratki segment između spiralne domene i Ig-like domene, koji se sastoji od jednog antiparalelnog trolančanog β-sloja (lanci A, B i C), male 310 spirale i nekoliko dugih nasumičnih spiralnih segmenata.(Slika S7).Čini se da mreža kovalentnih i elektrostatskih kontakata u zglobnoj regiji stabilizira orijentaciju između 4HB i domene slične Ig.Mreža se može podijeliti u tri dijela.Prvi dio uključuje dva CXXC motiva (27CXXC30 i 139CXXC142) koji tvore par disulfidnih veza između β-ukosnice u zglobu i 1′ spirale u 4HB.Drugi dio uključuje elektrostatske interakcije između Ig-slične domene i zgloba.Glu132 u zglobu tvori slani most s Arg233 u domeni sličnoj Ig i Arg135 u zglobu.Treći dio uključuje kovalentnu vezu između Ig-slične domene i zglobne regije.Dvije disulfidne veze (Cys124-Cys147 i Cys128-Cys153) povezuju zglobnu petlju s veznikom koji je stabiliziran elektrostatskim interakcijama između Gln131 i funkcionalne skupine okosnice, dopuštajući pristup prvoj domeni sličnoj Ig.lanac.
Struktura ektodomene SPACA6 i pojedinačne strukture 4HB i domena sličnih Ig korištene su za traženje strukturno sličnih zapisa u bazama podataka proteina 42 .Identificirali smo podudaranja s visokim Dali Z rezultatima, malim standardnim odstupanjima i velikim LALI rezultatima (potonji je broj strukturno ekvivalentnih ostataka).Dok je prvih 10 pogodaka iz pretraživanja pune ektodomene (Tablica S1) imalo prihvatljiv Z-rezultat >842, pretraživanje samo 4HB ili domene slične Ig-u pokazalo je da većina tih pogodaka odgovara samo β-sendvičima.sveprisutni nabor koji se nalazi u mnogim proteinima.Sve tri pretrage u Daliju dale su samo jedan rezultat: IZUMO1.
Dugo se sugeriralo da SPACA6 i IZUMO1 dijele strukturne sličnosti7,32,37.Iako ektodomene ovih dvaju proteina povezanih sa fuzijom gameta dijele samo 21% identičnosti sekvenci (Slika S8a), složeni dokazi, uključujući očuvani uzorak disulfidne veze i predviđenu C-terminalnu domenu sličnu Ig u SPACA6, omogućili su rane pokušaje izgradnje homološki model miša A a SPACA6 koristeći IZUMO1 kao predložak37.Naša struktura potvrđuje ova predviđanja i pokazuje pravi stupanj sličnosti.Zapravo, strukture SPACA6 i IZUMO137,43,44 dijele istu dvodomensku arhitekturu (Sl. S8b) sa sličnim 4HB i Ig-sličnim β-sendvič domenama povezanim zglobnom regijom (Sl. S8c).
IZUMO1 i SPACA6 4HB imaju zajedničke razlike od konvencionalnih spiralnih snopova.Tipični 4HB, poput onih pronađenih u proteinskim kompleksima SNARE koji su uključeni u endosomsku fuziju 45,46, imaju ravnomjerno raspoređene spirale koje održavaju konstantnu zakrivljenost oko središnje osi 47. Nasuprot tome, spiralne domene u IZUMO1 i SPACA6 bile su iskrivljene, s promjenjivom zakrivljenošću i neravnomjerno pakiranje (Slika S8d).Uvijanje, vjerojatno uzrokovano trokutom formiranim spiralama 1′, 1 i 2, zadržano je u IZUMO1 i SPACA6 i stabilizirano istim CXXC motivom na spirali 1′.Međutim, dodatna disulfidna veza pronađena u SPACA6 (Cys41 i Cys55 kovalentno povezuju spirale 1 i 2 iznad) stvara oštriji vrh na vrhu trokuta, čineći SPACA6 uvrnutijim od IZUMO1, s izraženijim trokutima šupljina.Osim toga, IZUMO1 nema Arg37 koji je opažen u središtu ove šupljine u SPACA6.Nasuprot tome, IZUMO1 ima tipičniju hidrofobnu jezgru alifatskih i aromatskih ostataka.
IZUMO1 ima domenu sličnu Ig-u koja se sastoji od dvolančane i peterolančane β-ploče43.Dodatna nit u IZUMO1 zamjenjuje zavojnicu u SPACA6, koja je u interakciji s F žicom kako bi ograničila glavne vodikove veze u žici.Zanimljiva točka usporedbe je predviđeni površinski naboj Ig-sličnih domena dvaju proteina.Površina IZUMO1 je negativnije nabijena od površine SPACA6.Dodatni naboj nalazi se u blizini C-kraja okrenutog prema membrani spermija.U SPACA6, iste regije bile su neutralnije ili pozitivno nabijene (slika S8e).Na primjer, hidrofobna površina (tanji rubovi) i pozitivno nabijene jame (širi rubovi) u SPACA6 su negativno nabijeni u IZUMO1.
Iako su odnos i elementi sekundarne strukture između IZUMO1 i SPACA6 dobro očuvani, strukturno poravnanje domena sličnih Ig-u pokazalo je da se dvije domene razlikuju u svojoj općoj orijentaciji jedna u odnosu na drugu (Sl. S9).Spiralni snop IZUMO1 je zakrivljen oko β-sendviča, stvarajući prethodno opisani oblik "bumeranga" na oko 50° od središnje osi.Nasuprot tome, spiralna zraka u SPACA6 bila je nagnuta oko 10° u suprotnom smjeru.Razlike u ovim orijentacijama vjerojatno su posljedica razlika u području zgloba.Na primarnoj razini sekvence, IZUMO1 i SPACA6 dijele malo sličnosti sekvence na zglobu, s izuzetkom ostataka cisteina, glicina i asparaginske kiseline.Zbog toga su vodikove veze i elektrostatske mreže potpuno različite.Elemente sekundarne strukture β-lista dijele IZUMO1 i SPACA6, iako su lanci u IZUMO1 puno duži, a spirala 310 (heliks 5) jedinstvena je za SPACA6.Te razlike rezultiraju različitim orijentacijama domena za dva inače slična proteina.
Naša pretraga poslužitelja Dali otkrila je da su SPACA6 i IZUMO1 jedine dvije eksperimentalno utvrđene strukture pohranjene u bazi podataka proteina koje imaju ovaj određeni 4HB nabor (Tablica S1).Nedavno je DeepMind (Alphabet/Google) razvio AlphaFold, sustav temeljen na neuralnim mrežama koji može točno predvidjeti 3D strukture proteina iz primarnih sekvenci48.Ubrzo nakon što smo riješili strukturu SPACA6, objavljena je baza podataka AlphaFold, pružajući modele prediktivne strukture koji pokrivaju 98,5% svih proteina u ljudskom proteomu48,49.Korištenjem naše riješene strukture SPACA6 kao modela pretraživanja, traženje strukturne homologije za model u AlphaFold ljudskom proteomu identificiralo je kandidate s mogućim strukturnim sličnostima sa SPACA6 i IZUMO1.S obzirom na nevjerojatnu točnost AlphaFolda u predviđanju SPACA6 (Slika S10a)—posebice ektodomene od 1,1 Å rms u usporedbi s našom razriješenom strukturom (Slika S10b)—možemo biti uvjereni da će identificirana podudaranja SPACA6 vjerojatno biti točna.
Prethodno je PSI-BLAST tražio klaster IZUMO1 s tri druga proteina povezana sa spermom: IZUMO2, IZUMO3 i IZUMO450.AlphaFold je predvidio da se ti proteini obitelji IZUMO savijaju u domenu 4HB s istim uzorkom disulfidne veze kao IZUMO1 (slike 3a i S11), iako im nedostaje domena slična Ig-u.Pretpostavlja se da su IZUMO2 i IZUMO3 jednostrani membranski proteini slični IZUMO1, dok se čini da se IZUMO4 izlučuje.Funkcije IZUMO 2, 3 i 4 proteina u fuziji gameta nisu utvrđene.Poznato je da IZUMO3 igra ulogu u biogenezi akrosoma tijekom razvoja spermija51 i otkriveno je da protein IZUMO tvori kompleks50.Očuvanje IZUMO proteina kod sisavaca, gmazova i vodozemaca sugerira da je njihova potencijalna funkcija u skladu s onom drugih poznatih proteina povezanih s fuzijom gameta, kao što su DCST1/2, SOF1 i FIMP.
Dijagram arhitekture domene superobitelji IST, s 4HB, šarkom i domenama sličnim Ig istaknutim narančastom, zelenom i plavom bojom.IZUMO4 ima jedinstvenu C-terminalnu regiju koja izgleda crno.Potvrđene i pretpostavljene disulfidne veze prikazane su punim i isprekidanim linijama.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) i TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) prikazani su u istom rasponu boja kao ploča A. Disulfidne veze prikazane su u magenta boji.TMEM95, IZUMO2 i IZUMO3 transmembranske spirale nisu prikazane.
Za razliku od IZUMO proteina, za druge SPACA proteine ​​(tj. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 i SPACA9) se smatra da se strukturno razlikuju od SPACA6 (slika S12).Samo SPACA9 ima 4HB, ali se ne očekuje da ima istu paralelno-antiparalelnu orijentaciju ili istu disulfidnu vezu kao SPACA6.Samo SPACA1 ima sličnu domenu sličnu Ig.AlphaFold predviđa da SPACA3, SPACA4 i SPACA5 imaju potpuno drugačiju strukturu od SPACA6.Zanimljivo, poznato je da SPACA4 također igra ulogu u oplodnji, ali u većoj mjeri nego SPACA6, umjesto da olakšava interakciju između sperme i oocita zona pellucida52.
Naša AlphaFold pretraga pronašla je drugo podudaranje za IZUMO1 i SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, jedan transmembranski protein specifičan za spermu, čini mužjake miševa neplodnim nakon ablacije 32,33.Spermiji bez TMEM95 imali su normalnu morfologiju, pokretljivost i sposobnost prodiranja u zonu pelucidu i vezivanja za membranu jajne stanice, ali se nisu mogli stopiti s membranom jajne stanice.Prethodne studije pokazale su da TMEM95 dijeli strukturne sličnosti s IZUMO133.Doista, model AlphaFold potvrdio je da je TMEM95 4HB s istim parom CXXC motiva kao IZUMO1 i SPACA6 i istom dodatnom disulfidnom vezom između spirala 1 i 2 koja se nalazi u SPACA6 (sl. 3a i S11).Iako TMEM95 nema domenu sličnu Ig-u, ima područje s uzorkom disulfidne veze slično SPACA6 i IZUMO1 zglobnim regijama (slika 3b).U vrijeme objavljivanja ovog rukopisa, poslužitelj za pretisak prijavio je strukturu TMEM95, potvrđujući rezultat AlphaFold53.TMEM95 je vrlo sličan SPACA6 i IZUMO1 i evolucijski je očuvan već kod vodozemaca (Sl. 4 i S13).
PSI-BLAST pretraga koristila je baze podataka NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP i SOF1 za određivanje položaja ovih sekvenci u stablu života.Udaljenosti između točaka grananja nisu prikazane u mjerilu.
Zapanjujuća sveukupna strukturna sličnost između SPACA6 i IZUMO1 sugerira da su oni osnivači očuvane strukturne superobitelji koja uključuje TMEM95 i IZUMO 2, 3 i 4 proteine.poznati članovi: IZUMO1, SPACA6 i TMEM95.Budući da samo nekoliko članova posjeduje Ig-slične domene, zaštitni znak IST superobitelji je 4HB domena, koja ima jedinstvene značajke zajedničke svim ovim proteinima: 1) Zavojni 4HB sa spiralama raspoređenim u anti-paralelnoj/paralelnoj izmjeni (Sl. 5a), 2) snop ima trokutasto lice koje se sastoji od dvije spirale unutar snopa i treće okomite spirale (Sl. ključno područje (Sl. 5c). Poznato je da CXXC motiv, koji se nalazi u proteinima sličnim tioredoksinu, funkcionira kao redoks senzor 54,55,56, dok se motiv u članovima obitelji IST može povezati s protein disulfid izomerazama kao što je ERp57 u fuziji gameta.Uloge su povezane 57,58.
Članovi superobitelji IST definirani su s tri karakteristične značajke 4HB domene: četiri spirale koje se izmjenjuju između paralelne i antiparalelne orijentacije, ba-trokutasta spiralna lica snopa i ca CXXC dvostruki motiv formiran između malih molekula.) N-terminalne spirale (narančasto) i područje zgloba β-ukosnica (zeleno).
S obzirom na sličnost između SPACA6 i IZUMO1, testirana je sposobnost prvog da se veže na IZUMO1 ili JUNO.Interferometrija biosloja (BLI) je metoda vezanja temeljena na kinetici koja se prethodno koristila za kvantificiranje interakcije između IZUMO1 i JUNO.Nakon inkubacije biotinom obilježenog senzora s IZUMO1 kao mamcem s visokom koncentracijom JUNO analita, detektiran je snažan signal (Sl. S14a), koji ukazuje na promjenu debljine biomaterijala pričvršćenog na vrh senzora izazvanu vezanjem.Slični signali (tj. JUNO povezan sa senzorom kao mamac protiv IZUMO1 analita) (Sl. S14b).Nije otkriven nikakav signal kada je SPACA6 korišten kao analit protiv IZUMO1 vezanog za senzor ili JUNO vezanog za senzor (Slika S14a,b).Odsutnost ovog signala ukazuje da izvanstanična domena SPACA6 ne stupa u interakciju s izvanstaničnom domenom IZUMO1 ili JUNO.
Budući da se BLI test temelji na biotinilaciji slobodnih lizinskih ostataka na proteinu mamca, ova modifikacija može spriječiti vezanje ako su lizinski ostaci uključeni u interakciju.Osim toga, orijentacija vezanja u odnosu na senzor može stvoriti steričke smetnje, tako da su konvencionalni testovi padanja također izvedeni na rekombinantnim SPACA6, IZUMO1 i JUNO ektodomenama.Unatoč tome, SPACA6 nije precipitirao s His-označenim IZUMO1 ili His-označenim JUNO (Sl. S14c,d), što ukazuje da nema interakcije koja bi bila u skladu s onom opaženom u BLI eksperimentima.Kao pozitivnu kontrolu, potvrdili smo interakciju JUNO s označenim Hisom IZUMO1 (slike S14e i S15).
Unatoč strukturnoj sličnosti između SPACA6 i IZUMO1, nemogućnost SPACA6 da veže JUNO nije iznenađujuća.Površina ljudskog IZUMO1 ima više od 20 ostataka koji su u interakciji s JUNO, uključujući ostatke iz svake od tri regije (iako se većina njih nalazi u zglobnoj regiji) (Sl. S14f).Od ovih ostataka samo je jedan sačuvan u SPACA6 (Glu70).Dok su mnoge zamjene ostataka zadržale svoja izvorna biokemijska svojstva, esencijalni ostatak Arg160 u IZUMO1 zamijenjen je negativno nabijenim Asp148 u SPACA6;prethodne studije su pokazale da mutacija Arg160Glu u IZUMO1 gotovo u potpunosti poništava vezanje za JUNO43.Osim toga, razlika u orijentaciji domene između IZUMO1 i SPACA6 značajno je povećala površinu JUNO-veznog mjesta ekvivalentne regije na SPACA6 (Sl. S14g).
Unatoč poznatoj potrebi za SPACA6 za fuziju gameta i njegovoj sličnosti s IZUMO1, čini se da SPACA6 nema ekvivalentnu funkciju vezanja JUNO.Stoga smo nastojali kombinirati naše strukturne podatke s dokazima o važnosti koje pruža evolucijska biologija.Usklađivanje sekvenci homologa SPACA6 pokazuje očuvanje zajedničke strukture izvan sisavaca.Na primjer, ostaci cisteina prisutni su čak i kod daleko srodnih vodozemaca (slika 6a).Korištenjem ConSurf poslužitelja, višestruki podaci o zadržavanju poravnanja sekvenci od 66 sekvenci mapirani su na površinu SPACA6.Ova vrsta analize može pokazati koji su ostaci sačuvani tijekom evolucije proteina i može pokazati koja površinska područja igraju ulogu u funkciji.
a Usklađivanje sekvenci SPACA6 ektodomena iz 12 različitih vrsta pripremljeno korištenjem CLUSTAL OMEGA.Prema ConSurf analizi plavom bojom označene su najkonzervativnije pozicije.Cisteinski ostaci označeni su crvenom bojom.Granice domene i elementi sekundarne strukture prikazani su na vrhu poravnanja, gdje strelice označavaju β-nitove, a valovi spirale.NCBI pristupni identifikatori koji sadrže nizove su: čovjek (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapucin majmun (Cebus mimic, XP_017359366), konj (Equus caballus, XP_023506102), kit ubojica (Orc inus orca3_23 XP_032_034) .), ovca (Ovis aries, XP_014955560), slon (Loxodonta africana, XP_010585293), pas (Canis lupus familyis, XP_025277208), miš (Mus musculus, NP_001156381), tasmanijski vrag (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0 318), Platypus, 8) , 61_89 i Žaba (Bufo bufo, XP_040282113).Numeriranje se temelji na ljudskom redu.b Površinski prikaz strukture SPACA6 s 4HB na vrhu i Ig-sličnom domenom na dnu, boje temeljene na procjeni očuvanja s poslužitelja ConSurf.Najbolje očuvani dijelovi su plavom bojom, srednje očuvani dijelovi bijelom, a najslabije očuvani žutom bojom.ljubičasti cistein.Tri površinske zakrpe koje pokazuju visoku razinu zaštite prikazane su u umetku označenim zakrpama 1, 2 i 3. Crtani crtež 4HB prikazan je u umetku gore desno (ista shema boja).
Struktura SPACA6 ima tri visoko očuvana površinska područja (slika 6b).Patch 1 obuhvaća 4HB i zglobnu regiju i sadrži dva očuvana CXXC disulfidna mosta, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 zglobnu mrežu (Sl. S7) i tri očuvana vanjska aromatska ostatka (Phe31, Tyr73, Phe137)).širi rub Ig-like domene (slika S6e), koja predstavlja nekoliko pozitivno nabijenih ostataka na površini spermija.Zanimljivo je da ovaj flaster sadrži epitop antitijela za koji je ranije pokazano da ometa funkciju SPACA6 30.Regija 3 obuhvaća zglob i jednu stranu domene slične Ig;ovo područje sadrži očuvane proline (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) i polarne/nabijene ostatke okrenute prema van.Iznenađujuće, većina ostataka na površini 4HB vrlo je varijabilna (Sl. 6b), iako je nabor očuvan u cijelom homologu SPACA6 (kao što je naznačeno konzervativnošću jezgre hidrofobnog snopa) i izvan superobitelji IST.
Iako je ovo najmanja regija u SPACA6 s najmanje detektabilnih elemenata sekundarne strukture, mnogi ostaci regije zgloba (uključujući regiju 3) visoko su očuvani među homolozima SPACA6, što može ukazivati ​​na to da orijentacija spiralnog snopa i β-sendviča igra ulogu.kao konzervativac.Međutim, unatoč opsežnim vodikovim vezama i elektrostatičkim mrežama u zglobnom području SPACA6 i IZUMO1, dokaz intrinzične fleksibilnosti može se vidjeti u poravnanju više dopuštenih struktura IZUMO137,43,44.Poravnanje pojedinačnih domena dobro se preklapalo, ali je orijentacija domena jedna u odnosu na drugu varirala od 50° do 70° od središnje osi (Sl. S16).Kako bi se razumjela konformacijska dinamika SPACA6 u otopini, izvedeni su eksperimenti SAXS (Sl. S17a,b).Ab initio rekonstrukcija ektodomene SPACA6 odgovarala je štapićastoj kristalnoj strukturi (Sl. S18), iako je Kratky dijagram pokazao određeni stupanj fleksibilnosti (Sl. S17b).Ova konformacija je u suprotnosti s IZUMO1, u kojem nevezani protein poprima oblik bumeranga i u rešetki i u otopini43.
Kako bi se specifično identificiralo fleksibilno područje, provedena je masena spektroskopija vodikovo-deuterijeve izmjene (H-DXMS) na SPACA6 i uspoređena s podacima prethodno dobivenim na IZUMO143 (Sl. 7a,b).SPACA6 je očito fleksibilniji od IZUMO1, što dokazuje veća izmjena deuterija kroz strukturu nakon 100 000 s izmjene.U obje strukture, C-terminalni dio zglobne regije pokazuje visoku razinu razmjene, što vjerojatno dopušta ograničenu rotaciju 4HB i domena sličnih Ig relativno jedna prema drugoj.Zanimljivo je da je C-terminalni dio zgloba SPACA6, koji se sastoji od ostatka 147CDLPLDCP154, visoko očuvana regija 3 (Slika 6b), što vjerojatno ukazuje na to da je međudomenska fleksibilnost evolucijski očuvana značajka SPACA6.Prema analizi fleksibilnosti, podaci o toplinskom taljenju CD-a pokazali su da je SPACA6 (Tm = 51,2°C) manje stabilan od IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (Sl. S1e i S19).
a H-DXMS slike SPACA6 i b IZUMO1.Postotak izmjene deuterija određen je u naznačenim vremenskim točkama.Razine izmjene vodik-deuterij označene su bojom na gradijentnoj skali od plave (10%) do crvene (90%).Crne kutije predstavljaju područja visoke razmjene.Granice 4HB, zgloba i Ig-slične domene opažene u kristalnoj strukturi prikazane su iznad primarne sekvence.Razine izmjene deuterija na 10 s, 1000 s i 100 000 s ucrtane su na trakasti dijagram superponiran na prozirne molekularne površine SPACA6 i IZUMO1.Dijelovi struktura s razinom izmjene deuterija ispod 50% obojeni su bijelom bojom.Područja iznad 50% H-DXMS izmjene obojena su u gradijentnoj skali.
Korištenje CRISPR/Cas9 i genetskih strategija izbacivanja gena miša dovelo je do identifikacije nekoliko čimbenika važnih za vezanje i fuziju spermija i jajne stanice.Osim dobro karakterizirane interakcije IZUMO1-JUNO i strukture CD9, većina proteina povezanih sa fuzijom gameta ostaje strukturno i funkcionalno zagonetna.Biofizička i strukturna karakterizacija SPACA6 još je jedan dio molekularne slagalice adhezije/fuzije tijekom oplodnje.
Čini se da su SPACA6 i drugi članovi superobitelji IST vrlo očuvani kod sisavaca, kao i kod pojedinačnih ptica, gmazova i vodozemaca;zapravo, smatra se da je SPACA6 čak potreban za oplodnju kod zebrica 59. Ova distribucija je slična drugim poznatim proteinima povezanim sa fuzijom gameta kao što su DCST134, DCST234, FIMP31 i SOF132, što sugerira da su ovi faktori deficijentni HAP2 (također poznati kao GCS1) proteini koji su odgovorni za katalitičku aktivnost mnogih protista., biljke i člankonošci.Oplođeni fuzijski proteini 60, 61. Unatoč velikoj strukturnoj sličnosti između SPACA6 i IZUMO1, izbacivanje gena koji kodiraju bilo koji od ovih proteina rezultiralo je neplodnošću u muških miševa, što ukazuje da se njihove funkcije u spajanju gameta ne dupliciraju..U širem smislu, niti jedan od poznatih proteina spermija potrebnih za fazu adhezije fuzije nije suvišan.
Ostaje otvoreno pitanje sudjeluju li SPACA6 (i drugi članovi superobitelji IST) u intergametskim spojevima, formiraju intragametske mreže za regrutiranje važnih proteina u fuzijske točke ili možda čak djeluju kao nedostižni fuzogeni.Studije koimunoprecipitacije u stanicama HEK293T otkrile su interakciju između IZUMO1 pune duljine i SPACA632.Međutim, naše rekombinantne ektodomene nisu međudjelovale in vitro, što sugerira da su interakcije viđene u Noda et al.oba su bila izbrisana u konstruktu (obratite pažnju na citoplazmatski rep IZUMO1, za koji se pokazalo da je nepotreban za oplodnju62).Alternativno, IZUMO1 i/ili SPACA6 mogu zahtijevati specifično okruženje vezanja koje ne reproduciramo in vitro, kao što su fiziološki specifične konformacije ili molekularni kompleksi koji sadrže druge proteine ​​(poznate ili još neotkrivene).Iako se vjeruje da ektodomena IZUMO1 posreduje u vezivanju spermija za jajašce u perivitelinskom prostoru, svrha ektodomene SPACA6 nije jasna.
Struktura SPACA6 otkriva nekoliko očuvanih površina koje mogu biti uključene u interakcije protein-protein.Sačuvani dio zglobne regije neposredno uz CXXC motiv (označen gore 1. zakrpom) ima nekoliko aromatskih ostataka okrenutih prema van koji su često povezani s hidrofobnim i π-slaganjem interakcija između biomolekula.Široke strane Ig-slične domene (regija 2) tvore pozitivno nabijeni žlijeb s visoko očuvanim Arg i His ostacima, a antitijela protiv ove regije prethodno su korištena za blokiranje fuzije gameta 30 .Antitijelo prepoznaje linearni epitop 212RIRPAQLTHRGTFS225, koji ima tri od šest argininskih ostataka i visoko konzervirani His220.Nije jasno je li disfunkcija uzrokovana blokadom ovih specifičnih ostataka ili cijele regije.Lokacija ove praznine u blizini C-kraja β-sendviča ukazuje na cis-interakcije sa susjednim proteinima spermija, ali ne i s proteinima oocita.Nadalje, zadržavanje visoko fleksibilnog spleta bogatog prolinom (mjesto 3) unutar zgloba može biti mjesto interakcije protein-protein ili, vjerojatnije, ukazivati ​​na zadržavanje fleksibilnosti između dviju domena.Spol je važan za nepoznatu ulogu SPACA6.spajanje gameta.
SPACA6 ima svojstva međustaničnih adhezijskih proteina, uključujući Ig-slične β-sendviče.Mnogi adhezivni proteini (npr. kadherini, integrini, adhezini i IZUMO1) posjeduju jednu ili više β-sendvič domena koje protežu proteine ​​od stanične membrane do njihovih okolišnih ciljeva63,64,65.Ig-slična domena SPACA6 također sadrži motiv koji se obično nalazi u β-sendvičima adhezije i kohezije: dublete paralelnih niti na krajevima β-sendviča, poznate kao mehaničke stezaljke66.Vjeruje se da ovaj motiv povećava otpornost na sile smicanja, što je dragocjeno za proteine ​​uključene u međustanične interakcije.Međutim, unatoč ovoj sličnosti s adhezinima, trenutno nema dokaza da SPACA6 stupa u interakciju s bjelanjcima.Ektodomena SPACA6 ne može se vezati za JUNO, a stanice HEK293T koje eksprimiraju SPACA6, kao što je ovdje prikazano, teško stupaju u interakciju s oocitima kojima nedostaje zona 32.Ako SPACA6 uspostavi intergametske veze, ove interakcije mogu zahtijevati posttranslacijske modifikacije ili biti stabilizirane drugim proteinima sperme.U prilog potonjoj hipotezi, spermatozoidi s nedostatkom IZUMO1 vežu se za oocite, pokazujući da su druge molekule osim IZUMO1 uključene u korak adhezije gameta 27 .
Mnogi virusni, stanični i razvojni fuzijski proteini imaju svojstva koja predviđaju njihovu funkciju kao fuzogena.Na primjer, virusni fuzijski glikoproteini (klase I, II i III) imaju hidrofobni fuzijski peptid ili petlju na kraju proteina koji je umetnut u membranu domaćina.Karta hidrofilnosti IZUMO143 i struktura (određena i predviđena) superobitelji IST nisu pokazale nikakav očiti hidrofobni fuzijski peptid.Dakle, ako bilo koji proteini u IST superobitelji funkcioniraju kao fuzogeni, oni to rade na način drugačiji od ostalih poznatih primjera.
Zaključno, funkcije članova IST superobitelji proteina povezanih sa fuzijom gameta ostaju primamljiva misterija.Naša karakterizirana rekombinantna molekula SPACA6 i njezina riješena struktura pružit će uvid u odnose između ovih zajedničkih struktura i njihovu ulogu u vezivanju i fuziji gameta.
DNA sekvenca koja odgovara predviđenoj ljudskoj SPACA6 ektodomeni (NCBI pristupni broj NP_001303901.1; ostaci 27-246) kodonski je optimizirana za ekspresiju u stanicama Drosophila melanogaster S2 i sintetizirana kao fragment gena sa sekvencom koja kodira Kozak (Eurofins Genomics)., signal izlučivanja BiP i odgovarajuće 5' i 3' krajeve za kloniranje ovog gena neovisno o vezivanju u vektor ekspresije pMT na temelju metalotioneinskog promotora modificiranog za selekciju s puromicinom (pMT-puro).Vektor pMT-puro kodira mjesto cijepanja trombinom nakon čega slijedi 10x-His C-terminalna oznaka (Slika S2).
Stabilna transfekcija vektora SPACA6 pMT-puro u stanice D. melanogaster S2 (Gibco) provedena je slično protokolu korištenom za IZUMO1 i JUNO43.S2 stanice su odmrznute i uzgojene u Schneiderovom mediju (Gibco) dopunjenom konačnom koncentracijom od 10% (v/v) toplinski inaktiviranog fetalnog telećeg seruma (Gibco) i 1X antimikotičkog antibiotika (Gibco).Stanice rane pasaže (3,0 x 106 stanica) su posađene u pojedinačne jažice ploča sa 6 jažica (Corning).Nakon 24 sata inkubacije na 27°C, stanice su transfektirane sa smjesom od 2 mg vektora SPACA6 pMT-puro i reagensa za transfekciju Effectene (Qiagen) prema protokolu proizvođača.Transfektirane stanice su inkubirane 72 sata i zatim sakupljene sa 6 mg/ml puromicina.Stanice su zatim izolirane iz kompletnog Schneiderova medija i stavljene u Insect-XPRESS medij bez seruma (Lonza) za proizvodnju proteina u velikim razmjerima.Šarža S2 stanične kulture od 1 L uzgojena je do 8-10 × 106 ml-1 stanica u polipropilenskoj Erlenmeyerovoj tikvici od 2 L s ventilacijom i potom sterilizirana s konačnom koncentracijom od 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) i sterilno filtrirana.induciran.Inducirane kulture su inkubirane na 27°C pri 120 okretaja u minuti četiri dana.
Kondicionirani medij koji je sadržavao SPACA6 izoliran je centrifugiranjem na 5660 x g na 4°C nakon čega je slijedio Centramate sustav filtracije tangencijalnog protoka (Pall Corp) s 10 kDa MWCO membranom.Nanesite koncentrirani medij koji sadrži SPACA6 na kolonu od 2 ml Ni-NTA agarozne smole (Qiagen).Ni-NTA smola je isprana s 10 volumena kolone (CV) pufera A i zatim je dodan 1 CV pufera A da se dobije konačna koncentracija imidazola od 50 mM.SPACA6 je eluiran s 10 ml pufera A dopunjenog imidazolom do konačne koncentracije od 500 mM.Trombin restrikcijske klase (Millipore Sigma) dodan je izravno u cijev za dijalizu (MWCO 12-14 kDa) u 1 jedinici po mg SPACA6 naspram 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 i 150 mM NaCl (pufer B) za dijalizu.) na 4°C 48 sati.Trombinom odcijepljeni SPACA6 je zatim razrijeđen trostruko da se smanji koncentracija soli i napunjen na 1 ml MonoS 5/50 GL kolonu za kationsku izmjenu (Cytiva/GE) uravnoteženu s 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Kationski izmjenjivač je ispran s 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, zatim je SPACA6 eluiran linearnim gradijentom od 0 do 500 mM NaCl u 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 za 25 CV.Nakon kromatografije ionske izmjene, SPACA6 je koncentriran do 1 ml i eluiran izokratski iz kolone ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) uravnotežene s puferom B. Prema kromatogramu, spojite i koncentrirajte frakcije koje sadrže SPACA6.Čistoća je kontrolirana elektroforezom obojenom Coomassie na 16% SDS-poliakrilamidnom gelu.Koncentracija proteina kvantificirana je apsorbancijom na 280 nm korištenjem Beer-Lambertova zakona i teorijskog koeficijenta molarne ekstinkcije.
Pročišćeni SPACA6 je dijaliziran preko noći protiv 10 mM natrijevog fosfata, pH 7,4 i 150 mM NaF i razrijeđen do 0,16 mg/mL prije analize CD spektroskopijom.Spektralno skeniranje CD-a valne duljine od 185 do 260 nm prikupljeno je na Jasco J-1500 spektropolarimetru korištenjem kvarcnih kiveta s optičkom duljinom putanje od 1 mm (Helma) pri 25°C brzinom od 50 nm/min.CD spektri su ispravljeni na osnovnoj liniji, usrednjeni za 10 snimanja i pretvoreni u srednju rezidualnu eliptičnost (θMRE) u stupnjevima cm2/dmol:
gdje je MW molekulska težina svakog uzorka u Da;N je broj aminokiselina;θ je eliptičnost u milistupenjima;d odgovara duljini optičkog puta u cm;koncentracija proteina u jedinicama.