310 10*1mm spiralna cijev od nehrđajućeg čelika, kemijska komponenta, N-terminalne domene spidroina tvore hidrogelove na temelju amiloidnih fibrila i osiguravaju platformu za imobilizaciju proteina.

Hvala što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, web stranicu prikazujemo bez stilova i JavaScripta.
Klizači koji prikazuju tri članka po slajdu.Za pomicanje kroz slajdove koristite gumbe Natrag i Sljedeće ili gumbe za upravljanje slajdovima na kraju za kretanje kroz svaki slajd.

Specifikacija

310 Dobavljači spiralnih cijevi od nehrđajućeg čelika 10*1 mm

Kemijski sastav

Mehanička svojstva

Rekombinantni proteini paukove svile (proteini paukove svile) imaju mnoge potencijalne primjene u razvoju novih biomaterijala, ali njihova multimodalna priroda i priroda sklona agregaciji čini ih teškima za nabavu i laku za upotrebu.Ovdje izvješćujemo da rekombinantni minijaturni proteini spidroina i, što je još važnije, sama N-terminalna domena (NT) brzo stvaraju samodržive i prozirne hidrogelove na 37 °C.fuzijski proteini koji se sastoje od NT i zelenog fluorescentnog proteina ili purinske nukleozid fosforilaze tvore potpuno funkcionalne fuzijske proteine.Hidrogeli.Naši rezultati pokazuju da rekombinantni NT i fuzijski proteini daju visoke prinose ekspresije i daju hidrogelovima atraktivna svojstva kao što su prozirnost, geliranje bez umrežavanja i izravna imobilizacija aktivnih proteina visoke gustoće.
Pauci imaju čak sedam različitih skupova svilenih žlijezda, od kojih svaka proizvodi određenu vrstu svile.Svih sedam vrsta svile sastavljeno je od proteina paukove svile (spidroina) dugih približno 6000 ostataka i sadrže veliko središnje ponavljajuće područje okruženo sferičnim N- i C-terminalnim domenama (NT i CT)1,2.Najproučeniju vrstu svile, primarnu ampulu, proizvodi primarna ampulna žlijezda.U ovoj žlijezdi, monosloj epitelnih stanica sintetizira proteine ​​spidroina i izlučuje ih u lumen žlijezde, gdje su prisutni u topljivom obliku (doping) u iznimno visokim koncentracijama (30-50% w/v)3,4.Raspravljalo se o organizaciji i konformaciji glavnih ampularnih spidroinskih proteina u žlijezdi, ali većina eksperimentalnih dokaza ukazuje na prisutnost općenito spiralne i/ili nasumične spiralne konformacije i micelarne ili lamelarne strukture5,6,7,8,9,10.Dok ponavljajuće domene reguliraju mehanička svojstva vlakana svile, tvoreći nanokristale β-lista i amorfne strukture11,12,13,14,15, krajnje domene reguliraju vlakna svile kao odgovor na promjenjive uvjete duž žlijezde svile16,17,18.Kontroliranjem stvaranja svile, 19. Terminalne domene su evolucijski očuvane i njihova funkcija može biti zajednička svim proteinima spidroina 2,20,21.Tijekom prolaska kroz žlijezdu, pH spidroina se smanjuje s oko 7,6 na < 5,716 i povećava smicanjem i istezanjem posredovanim kretanjem kroz kanal koji se postupno sužava.U otopini, CT je α-spiralni konstitutivni paralelni dimer17, ali kao odgovor na nizak pH i sile smicanja, CT se razvija i prebacuje β-slojeve16, 17, moguće pokrećući β-slojeve u ponavljajućim regijama Convert 16. NT su monomerni pod uvjeti koji odražavaju uvjete u lumenu žlijezde i posreduju u topljivosti spidroina, ali pri smanjenom pH, protonacija niza bočnih lanaca karboksilne kiseline dovodi do dimerizacije NT s pKa od približno 6,5, čime se stabilizira NT i fiksira spidroin u velikim količinama.mreže16,18.Stoga NT igra ključnu ulogu u formiranju filamenta, mijenjajući se iz monomera u prevlaci u dimer u vlaknu23,24,25.NT ostaje visoko topljiv i spiralan u svim uvjetima koji su do danas proučavani 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, što je nadahnulo njegov razvoj kao oznake za povećanje topljivosti za proizvodnju heterolognih proteina.
Rekombinantni mini protein paukove svile, koji se sastoji od jednog NT, jednog kratkog ponavljajućeg područja, jednog CT-a i His6 oznake (His-NT2RepCT) za pročišćavanje, jednako je topiv u vodenom puferu kao i prirodni protein paukove svile i oponaša prirodne važne karakteristike svilenog pauka .pokrivenost 25.31.His-NT2RepCT može se ispredati u kontinuirana vlakna pomoću biomimetičkog stroja u kojem se topljivi premaz pH 8 ekstrudira u vodenu kupelj pH 525,32,33,34,35.Bioreaktorska fermentacija E. coli koja eksprimira His-NT2RepCT i kasnija naknadna obrada rezultirali su prinosom >14 g/L nakon pročišćavanja.Visoki prinos, visoka topljivost i odgovarajući odgovor His-NT2RepCT na kisele uvjete pripisuju se NT23, 25, 34.
Ovdje izvješćujemo o brzom stvaranju prozirnih hidrogelova iz rekombinantnih proteina spidroina, uključujući sam NT, inkubiranjem otopine proteina na 37 °C.Koristeći fluorescenciju tioflavina T (ThT), infracrvenu spektroskopiju s Fourierovom transformacijom (FTIR), spektroskopiju nuklearne magnetske rezonancije (NMR) i transmisijsku elektronsku mikroskopiju (TEM), otkrili smo da proteini NT i mikropauk prolaze kroz strukturnu transformaciju u β-listove i fibrile slične amiloidu kada nastaju gelovi.Dodatno, fuzijski proteini NT i zeleni fluorescentni protein (GFP) ili purin nukleozid fosforilaze (PNP) tvore hidrogelove s potpuno funkcionalnim fuzijskim fragmentima.Ekspresija visoke propusnosti u heterolognim domaćinima, zajedno s brzim stvaranjem hidrogelova u fiziološkim uvjetima, otvara mogućnost isplative proizvodnje hidrogelova s ​​projektiranim funkcijama.
Za razliku od većine prijavljenih rekombinantnih spidroinskih proteina36, His-NT2RepCT je stabilan u Tris-HCl puferu pri pH 8 i može se koncentrirati do 500 mg/mL bez taloženja25.Stoga smo bili iznenađeni kada smo otkrili da ovaj protein brzo stvara optički prozirne, samodržive hidrogelove kada se inkubira na 37°C (Slika 1b-d).Daljnje studije su pokazale da se geliranje His-NT2RepCT dogodilo u širokom rasponu koncentracija proteina (10-300 mg/mL) i da je ta koncentracija bila u obrnutoj korelaciji s vremenom geliranja (Slika 1c i Dodatna slika 1).Kako bismo saznali koji dijelovi His-NT2RepCT-a posreduju u formiranju hidrogela, ispitali smo svaku domenu pojedinačno i u različitim kombinacijama pomoću testa inverzije tikvice (Slika 1a,b).Sve testirane frakcije rekombinantnog spidroina formirale su gel (pri koncentraciji proteina od 300 mg/mL) za manje od 1 h, osim za precipitirani 2Rep (slika 1b).Ovo sugerira da sami NT i CT, u kombinaciji ili povezani s ponavljanjima, mogu gelirati na 37°C i da oznaka His6 ne utječe na ovaj proces u značajnoj mjeri.S obzirom na uobičajenu predodžbu da je NT vrlo topiv i stabilan protein, te da su prethodna izvješća o rekombinantnim spidroin hidrogelovima pripisivala učinke geliranja konformacijskim promjenama u ponovljenim regijama i/ili CT-ovima, mogao bi i sam NT.Otkriće gelacije bilo je neočekivano.Dodatna tablica 1) 37, 38, 39. Zanimljivo je da je NT već gelirao unutar 10 minuta pri koncentraciji od ≥ 300 mg/mL (Slika 1c).Eksperimenti inverzije bočice s različitim koncentracijama NT pokazali su da pri >50 mg/mL otopina NT želira brže od His-NT2RepCT pri odgovarajućoj koncentraciji (w/v, slika 1c).
Shematski prikaz različitih spidroinskih konstrukata proučavanih u ovom radu.b Vrijeme geliranja na 37 °C za različite rekombinantne proteine ​​spidroina (300 mg/mL) potvrđeno okretanjem bočice.CT gel odmah bez inkubacije (<300 mg/mL), 2 Rep precipitata (300 mg/mL, 5 mm skala).c Vrijeme geliranja His-NT2RepCT i NT pri naznačenim koncentracijama proteina na 37°C.d Fotografije His-NT2RepCT i NT hidrogelova s ​​paukom i slovom "NT" otisnutim ispod (oba 200 mg/mL, skala 5 mm).
Hidrogelovi formirani od raznih rekombinantnih spidroinskih proteina imaju malo drugačije boje, a promatranje golim okom pokazuje različite stupnjeve prozirnosti (slika 1b).NT gelovi su iznimno prozirni dok drugi gelovi postaju neprozirni.His-NT2RepCT i NT gelovi izliveni u cilindrične cijevi mogu se netaknuti ukloniti iz kalupa (slika 1d).
Kako bi se ispitalo geliranje prirodnih premaza od paukove svile pod uvjetima za koje je sada utvrđeno da uzrokuju geliranje rekombinantnih proteina spidroina, premazi su sakupljeni iz velike žlijezde ampule švedskog mostnog pauka (Larinioides sclopetarius).Premazi su pohranjeni u 20 mM Tris-HCl puferu pri 50 mg/mL (na temelju izmjerene suhe težine), ali nije primijećena gelacija tijekom 21 dana inkubacije na 37 °C (dodatna slika 2a).
Za kvantificiranje ovih gelova mogu se koristiti reološka mjerenja za proučavanje procesa geliranja i određivanje ukupnih mehaničkih svojstava.Konkretno, praćenje modula skladištenja (elastičnosti) na povišenim temperaturama može pružiti informacije o temperaturi geliranja kao i o viskoelastičnim svojstvima premaza.Eksperimenti porasta temperature (koristeći 1°C/min na 25-45°C, temeljeno na prethodnim studijama uz korištenje osnovnih otopina prirodne svile)40,41 pokazali su da se moduli skladištenja otopina His-NT2RepCT i NT povećavaju s povećanjem temperature.je povećan (slika 2 i dopunska slika 3).Značajno je da je NT modul počeo rasti na nižoj temperaturi u usporedbi s His-NT2RepCT, u skladu s bržim vremenom geliranja primijećenim kada je NT izravno inkubiran s His-NT2RepCT na 37°C (Slika 1).Nakon naknadnog pada temperature, modul skladištenja nije se vratio na niže vrijednosti i ostao je iznad modula gubitka (vidi dodatnu sliku 3), što ukazuje na toplinski ireverzibilno stabilno geliranje.Nakon geliranja, konačni modul elastičnosti bio je u rasponu od 15 do 330 kPa za His-NT2RepCT hidrogelove pri koncentraciji od 100-500 mg/mL, a konačni modul elastičnosti za NT hidrogelove (100-500 mg/mL) u rasponu od 2 do 1400. kPa (Slika 2 i potpuni podaci o rampi) vidi Dodatnu sliku 3).
a Promjena temperature tijekom mjerenja His-NT2RepCT (300 mg/mL) i b NT (300 mg/mL) uz mućkanje.Strelice pokazuju temperaturni trend, a svjetlije sjenčanje podataka modula za pohranu prikazuje testiranje pri nižim vrijednostima zakretnog momenta za instrument od onih koje je naveo proizvođač, što je uzrok povećane buke.c Akumulacija His-NT2RepCT i NT na završnom modulu nakon povišene temperature (100, 300 i 500 mg/mL).Sva očitanja modula uzimaju se na frekvenciji od 0,1 Hz.
Kao potencijalnu metodu za istraživanje konformacijskih promjena povezanih s geliranjem, snimili smo FTIR spektre His-NT2RepCT i NT prije i poslije geliranja na 37°C (Slika 3a,b).Kao što se očekivalo, spektri otopina His-NT2RepCT i NT odgovarali su proteinima koji pokazuju sekundarnu strukturu α-heliksa/nasumične zavojnice, s izraženom vrpcom na 1645 cm-1.Za oba hidrogela, geliranje je rezultiralo stvaranjem dva kraka u srednjem I pojasu na oko 1617 cm-1 i 1695 cm-1 (Sl. 3a, b), što ukazuje na stvaranje antiparalelnih β-pločastih struktura.Ove se promjene također mogu jasno vidjeti u odgovarajućoj drugoj derivaciji i spektru geliranja razlike (dopunska slika 4b).Dvije vrpce NT β-sloja bile su izraženije od onih u His-NT2RepCT, što ukazuje da je ukupni sadržaj vrpci β-sloja u NT hidrogelu bio veći nego u NT2RepCT hidrogelu.
a FTIR apsorpcijski spektar His-NT2RepCT i b NT (oba 500 mg/mL) prije (otopina) i nakon (gel) inkubacije na 37°C.c TEM slike resuspendiranih 50 mg/ml NT2RepCT gelova i d NT.Ljestvica 200 nm.e Promjeri vlakana His-NT2RepCT i NT hidrogelova.n = 100 izmjerenih fibrila, p < 0,0001.Trake pogrešaka pokazuju standardnu ​​devijaciju.Središte stupaca pogrešaka je srednja vrijednost.Za statističku analizu korišten je nespareni t-test (dvostrani).f ThT fluorescencija različitih rekombinantnih spidroin proteina (100 mg/mL) na 37 °C bez mućkanja.g NT (100 mg/mL) eksperimenti inokulacije iz 100 mg/mL NT gela s 0%, 5%, 10% i 20% sjemena.
Analiza gela transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM) pokazala je da se hidrogel sastoji od fibrila sličnih amiloidu (sl. 3c, 3d).NT-formirane fibrile bile su produžene (5-12 nm u promjeru) i nerazgranate, dok su His-NT2RepCT fibrile bile kraće u duljini i značajno šire u promjeru (7-16 nm) (Slika 3e).Ovi rezultati omogućili su nam da pratimo kinetiku fibroze pomoću testa tioflavina T (ThT).Za sve rekombinantne proteine ​​spidroina, fluorescentni signal se povećao kada su uzorci inkubirani na 37 °C (Slika 3f, Dodatna slika 5a).U skladu s ovim nalazom, mikroskopski pregled NT i His-NT2RepCT u uvjetima geliranja otkrio je ujednačeno povećanje fluorescencije ThT bez primjetnog lokalnog nakupljanja ThT-pozitivnih agregata (dodatna slika 5b,c).Formiranje ThT-pozitivnih fibrila nije bilo popraćeno povećanjem zamućenja NT i His-NTCT (dodatna slika 5d), što znači da bi se mreža fibrila u gelu mogla formirati bez ugrožavanja bistrine gela.Zasijavanje dodavanjem malih količina prethodno oblikovanih fibrila može značajno ubrzati stvaranje fibrila nekih amiloida42,43,44 ali dodavanjem 5%, 10% ili 20% (w/w) NT u otopinu NT hidrokoagulansa.učinak zasijavanja (slika 3g).Možda je to zbog činjenice da su fibrile u hidrogelu relativno fiksirane i ne mogu se koristiti kao sjemenke.
Neočekivano ponašanje rekombinantnih proteina spidroina na visokim temperaturama potaknulo je daljnje studije spektroskopije nuklearne magnetske rezonancije (NMR) kako bi se identificirale konformacijske promjene povezane s stvaranjem gela.NMR spektri otopina His-NT2RepCT snimljeni tijekom vremena na 37°C pokazali su da je CT još uvijek djelomično presavijen, dok su signali NT i 2Rep nestali (Slika 4a), što sugerira da uglavnom NT i 2Rep djelomično kontroliraju stvaranje His- NT2RepCT hidrogel.CT signal također je oslabljen na 20% svog izvornog intenziteta, što sugerira da je CT također uglavnom fiksiran i ugrađen u strukturu hidrogela.Za manji dio CT-a, koji je pokretljiv kao u prethodno inkubiranom uzorku i stoga promatran pomoću NMR otopine, spektrima nedostaju signali za prvih 10 strukturiranih ostataka, vjerojatno zbog teške imobilizacije pričvršćenog dijela His-NT2Rep.NMR spektri -stanja hidrogelova -NT2RepCT otkrili su dominantnu prisutnost α-spirala i β-slojeva i, u manjoj mjeri, konformaciju nasumične zavojnice (Sl. 4b).Analiza kemijskog pomaka metioninskih ostataka prisutnih samo u NT pokazala je da je ova domena pretvorena u β-list strukturu.Vremenski ovisni spektri NT u otopini pokazali su ravnomjerno smanjenje intenziteta signala (Slika 4c), a NMR krutog stanja NT hidrogelova pokazao je da je većina NT ostataka pretvorena u β-pločaste strukture (Slika 4d).Konformacija 2Rep-a nije se mogla zasebno odrediti zbog njegove tendencije agregacije.Međutim, NMR spektri čvrstog stanja NTCT i His-NT2RepCT hidrogela izgledali su vrlo slično (Slika 4b; Dodatna slika 6b), što sugerira da je 2Rep malo pridonio strukturnom dijelu His-NT2RepCT hidrogela.Utvrđeno je da za CT hidrogelove postoje α-heliksi, β-plohe i nasumične spiralne sekundarne strukture (dodatna slika 6d).Ovo sugerira da neki dijelovi CT-a ostaju α-spirale, dok drugi postaju β-plohe.Dakle, rezultati NMR spektroskopije sugeriraju da je NT važan za formiranje hidrogela i također se transformira u konformaciju β-ploče nakon fuzije s 2Rep i CT.U skladu s tim, nedavno smo otkrili da se amiloidni prostorni patentni zatvarači vjerojatno formiraju u svih pet spirala NT domene, a Waltzov algoritam je predvidio amiloidogenu regiju u spirali 1 (slika 4e).
2D spektri 15N-HSQC 10 mg/mL otopine His-NT2RepCT prije (plavo) i 19 sati nakon inkubacije (crveno) na 37°C.Pojedinačni križni vrhovi u crvenom spektru i F24, G136, polyA u plavom spektru označeni su jednoslovnim simbolima aminokiselina i brojevima ostataka.Umetci pokazuju ovisnost intenziteta signala o vremenu za odabrane ostatke iz NT, 2Rep i CT domena.b Radiofrekvencijski spektri čvrstog stanja (RFDR) His-NT2RepCT hidrogelova.Korelacije Cα/Cβ ostataka uočenih u RFDR spektrima određene su usporedbom s modelnim kemijskim pomacima peptida i vrijednostima izvedenim iz statistike82,83 i njihovih sekundarnih struktura.SSB – rotirajući bočni pojas.c Jednodimenzionalni spektri otopine 15N-HSQC 10 mg/mL NT tijekom inkubacije na 37 °C tijekom 36 sati.Umetak prikazuje volumetrijski intenzitet u odnosu na vrijeme.d RFDR spektri čvrstog stanja NT hidrogelova.Navedene su korelacije Cα/Cβ ostataka i njihovih sekundarnih struktura opaženih u RFDR spektrima.e Na temelju NT45.79 profila sklonosti fibrilaciji iz baze podataka Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Rosetta energija prozora prostornog munjevitog pomaka heksapeptida prikazana je u kcal/mol.Crvene trake označavaju heksapeptide s visokom sklonošću fibrozi (Rosetta energija ispod -23 kcal/mol; ispod isprekidane linije).Zelene trake označavaju fragmente s Rosetta energijama iznad praga i stoga je manja vjerojatnost da će formirati steričke patentne zatvarače.Fragmenti koji sadrže prolin isključeni su iz analize (bez stupaca).Kvadratići označavaju područja amiloidoze predviđena Waltzovim algoritmom81 (https://waltz.switchlab.org).Redoslijed aminokiselinskih ostataka NT je na vrhu, a tipovi ostataka koji se nalaze u β sekundarnoj strukturi (određeni NMR spektroskopijom čvrstog stanja) prikazani su crvenom bojom.Položaji pet NT α-spirala označeni su kao (H1-H5)28.
Pri pH <6,5, HT dimerizira, otporan je na denaturaciju izazvanu toplinom ili ureom18.Da bi se razjasnilo kako dimerizacija i stabilnost NT utječu na geliranje, otopine koje sadrže 100 mg/ml NT kontrolirane su na pH 8, 7 i 6 pomoću testa inverzije bočice.NT uzorci inkubirani na pH 8 i 7 gelirali su se nakon 30 minuta na 37 °C, ali je gel s pH 8 ostao bistar, dok je gel s pH 7 pokazao vidljiv talog (Slika 5a).Nasuprot tome, otopina koja je sadržavala HT na pH 6 nije formirala gel, a veliki talog se mogao vidjeti nakon 20 minuta na 37°C.Ovo sugerira da sami dimeri i/ili njihova veća stabilnost u usporedbi s monomerima sprječavaju geliranje.Stvaranje taloga za NT pri pH 7 i 6 nije se očekivalo, jer je objavljeno da je NT topljiv pri 200 mg/ml27, lako se ponovno savija nakon toplinske denaturacije, a također zadržava α-heliks pri nižim vrijednostima pH 18. Vjerojatno objašnjenje ovih odstupanja je da su prethodno prijavljeni eksperimenti provedeni na sobnoj temperaturi ili nižoj, ili pri relativno niskim koncentracijama proteina16,18,19.
NT test inverzije bočice (100 mg/mL) na pH 8, 7, 6 i 154 mM NaCl (pH 8) nakon inkubacije na 37°C.b NT CD spektri sa i bez 154 mM NaF odnosno 154 mM NaCl.Molarna eliptičnost na 222 nm pretvara se u udio prirodnih nabora.c NT inverzijski test (100 mg/mL) NT* (37 °C i 60 °C), NTA72R (37 °C) i His-NT-L6 (37 °C i 60 °C).d CD spektri NT mutanata NT*, NTA72R i His-NT-L6.Molarna eliptičnost na 222 nm pretvara se u udio prirodnih nabora.e Inverzijski test NTFlSp, NTMiSp i smanjenog NTMiSp (100 mg/mL).Mjerna traka 5 mm.f CD spektri NT, NTFlSp, NTMiSp i reducirani NTMiSp.Molarna eliptičnost na 222 nm pretvara se u udio prirodnih nabora.Puni NT spektri na 25 °C i 95 °C prikazani su na dodatnoj slici 8.
Fiziološka koncentracija soli određuje elektrostatske interakcije između NT podjedinica i dimerizaciju prijenosa NT na niži pH18.Otkrili smo da prisutnost 154 mM NaCl i NaF doista inhibira geliranje (Slika 5a, b; Dodatna slika 2b) i da te soli povećavaju toplinsku stabilnost NT monomera (Slika 5b, Dodatna slika 8) .Također sugerira da povećanje stabilnosti, a ne dimerizacija, sprječava stvaranje gela.
Kako bismo dalje istražili ulogu dimerizacije i stabilnosti proteina u geliranju, upotrijebili smo dva mutanta, NT* i NTA72R, koji također ostaju monomerni pri niskom pH 28,30.NT* je mutant dvostrukog preokreta naboja u kojem je prividna distribucija dipolarnog naboja monomera spljoštena, što sprječava dimerizaciju i drastično povećava stabilnost monomera.NTA72R je nabijeni dipol, ali Arg-supstituirani Ala nalazi se na granici dimera, tako da mutacije ometaju interakcije podjedinica potrebne za dimerizaciju.Nakon inkubacije na 37°C, NT* nije stvorio hidrogel, dok je NTA72R stvorio neproziran gel tijekom 15 minuta (slika 5c).Budući da i NT* i NTA72R ne mogu dimerizirati, ali se razlikuju u stabilnosti monomera (slika 5d), ovi rezultati snažno sugeriraju da visoka termodinamička stabilnost sprječava geliranje NT.Ovo je također podržano činjenicom da HT* stvara gel kada je nestabilan na visokoj temperaturi (nakon 8 minuta na 60°C; slika 5c).Prethodno je pokazano da visok sadržaj metionina u NT ukapljuje njegovo prirodno savijanje i da šest zamjena Met u Leu (ovdje nazvanih His-NT-L6) snažno stabiliziraju monomer NT46.Na temelju pretpostavke da je strukturna fleksibilnost potrebna za formiranje NT gela, otkrili smo da stabilni mutant His-NT-L6 nije želiran na 37 °C (Slika 5c, d).Međutim, His-NT-L6 je također formirao gel nakon inkubacije na 60°S tijekom 60 minuta (slika 5c).
Čini se da se sposobnost NT da se transformira u strukture β-lista i oblikuje hidrogelove odnosi na neke, ali ne sve NT domene spidroina.NT iz različitih tipova svile i vrsta pauka, Trichonephila clavipes (NTFlSp), formirali su gelove unatoč relativno niskom sadržaju metionina i visokoj toplinskoj stabilnosti (Slika 5e, f i Dodatna tablica 2).Nasuprot tome, NT iz malog ampularnog proteina spidroina iz Araneus ventricosus (NTMiSp) s niskom toplinskom stabilnošću i visokim sadržajem metionina nije formirao hidrogelove (dodatna tablica 2 i slika 5e, f).Ovo posljednje može biti povezano s prisutnošću intramolekularnih disulfidnih veza29,47.Dosljedno, kada su disulfidne veze NTMiSp reducirane, formirao je hidrogel nakon inkubacije na 37°C tijekom 10 minuta (Sl. 5e).Zaključno treba napomenuti da je strukturna fleksibilnost važan, ali ne i jedini kriterij za nastanak gela iz NT.Još jedan čimbenik koji bi mogao biti relevantan je sklonost stvaranju amiloidnih fibrila, a analiza s bazom podataka zatvarača i Waltzovim algoritmom pokazala je korelaciju između sposobnosti stvaranja gela i prisutnosti amiloidogenih regija, kao i opsega predviđenih regija formirati steričke patentne zatvarače.Postojala je korelacija (dodatna tablica 2 i dopunska slika 9).
Sposobnost NT da formira fibrile i oblikuje gelove pod povoljnim uvjetima dovela nas je do hipoteze da NT fuzije s drugim proteinskim fragmentima još uvijek mogu formirati gelove s punom funkcijom partnera fuzije.Da bismo ovo testirali, uveli smo zeleni fluorescentni protein (GFP) i purin nukleozid fosforilaze (PNP) na C-završetak NT.Rezultirajući fuzijski proteini eksprimirani su u E. coli s vrlo visokim konačnim prinosima (150 mg/L i 256 mg/L kultura mućkane tikvice za His-NT-GFP odnosno His-NT-PNP), u skladu s onim što je prikazano za ostale proteine ​​spojene na NT Ref.30. His-NT-GFP (300 mg/mL) i His-NT-PNP (100 mg/mL) fuzijski proteini formirali su gel nakon 2 sata i 6,5 sati na 37°C i, što je važno, GFP frakcija je ostala nepromijenjena.uočeno nakon geliranja, s >70% početnog intenziteta fluorescencije preostalo nakon geliranja (slika 6a).Za mjerenje PNP aktivnosti u his-NT-PNP otopinama i gelovima, morali smo razrijediti fuzijski protein s NT jer je enzimska aktivnost čistog pripravka bila izvan raspona detekcije testa pri koncentracijama geliranja.Gel formiran sa smjesom koja sadrži 0,01 mg/mL His-NT-PNP i 100 mg/mL NT zadržao je 65% početne enzimske aktivnosti prethodno inkubiranih uzoraka (slika 6b).Gel je ostao netaknut tijekom mjerenja (dodatna slika 10).
a Relativni intenzitet fluorescencije prije i poslije geliranja His-NT-GFP (300 mg/mL) i okrenute bočice koja sadrži His-NT-GFP hidrogel (300 mg/mL) pod vidljivim i UV svjetlom.Točke prikazuju pojedinačna mjerenja (n = 3), stupci pogrešaka pokazuju standardnu ​​devijaciju.Prosječna vrijednost prikazana je u sredini traka pogrešaka.b Aktivnost PNP dobivena je fluorometrijskom analizom korištenjem otopina i gelova koji se sastoje od NT (100 mg/ml) i smjese koja sadrži 0,01 mg/ml his-NT-PNP i 100 mg/ml novih tajvanskih dolara.Umetak prikazuje okrenutu bočicu koja sadrži hidrogel koji sadrži His-NT-PNP (ljestvica od 5 mm).
Ovdje izvješćujemo o stvaranju hidrogelova iz NT i drugih rekombinantnih proteina spidroina inkubacijom otopine proteina na 37°C (slika 1).Pokazali smo da je geliranje povezano s transformacijom α-spirala u β-slojeve i stvaranjem fibrila nalik amiloidu (slike 3 i 4).Ovo otkriće je iznenađujuće budući da su NT namotani globularni snopovi s pet zavojnica poznati po svojoj izuzetno visokoj topivosti i visokoj stabilnosti pri koncentracijama >200 mg/mL na 4°C tijekom nekoliko dana27.Osim toga, NT se lako ponovno savijaju nakon toplinske denaturacije pri niskim koncentracijama proteina u µM.Prema našim rezultatima, stvaranje fibrila zahtijeva kombinaciju koncentracije proteina >10 mg/mL i blago povišene temperature (slika 1).To je u skladu s idejom da se amiloidne fibrile mogu formirati iz globularno naboranih proteina koji su u djelomično nesmotanom stanju zbog toplinskih fluktuacija pod fiziološkim uvjetima 48 .Primjeri proteina koji prolaze ovu konverziju uključuju inzulin49,50, β2-mikroglobulin, transtiretin i lizozim51,52,53.Iako je NT α-heliks u svom izvornom stanju, približno 65% polipeptidnog lanca je kompatibilno sa steričkim stvaranjem zatvarača (Sl. 4e) 45 .Budući da je monomer dinamički pokretljiv46, može izložiti ova potencijalna amiloidogena područja pri umjereno povišenim temperaturama i pri visokim koncentracijama ukupnog proteina može doseći kritičnu koncentraciju za stvaranje amiloidnih fibrila54.Slijedeći ovo razmišljanje, pronašli smo negativnu korelaciju između koncentracije spidroina i vremena geliranja (slika 1c), a ako se monomerna NT konformacija stabilizira bilo mutacijama (NT*, His-NT-L6) ili dodatkom soli, može spriječiti formiranje hidrogelova (slika 5).
U većini slučajeva amiloidne fibrile nestaju iz otopine kao talog, ali pod određenim uvjetima mogu formirati hidrogelove55,56,57.Vlakna koja stvaraju hidrogel tipično imaju visok omjer širine i visine i tvore stabilne trodimenzionalne mreže kroz molekularno ispreplitanje,55,58 u skladu s našim rezultatima.Za stvaranje hidrogela in vitro, proteini se često potpuno ili djelomično razmotaju, na primjer, izlaganjem organskim otapalima, visokoj temperaturi (70–90°C) i/ili niskom pH (1,5–3,0)59,60,61,62.Hidrogelovi spidroina koji su ovdje opisani ne zahtijevaju grubu obradu, niti su im potrebna sredstva za umrežavanje za stabilizaciju hidrogelova.
Prethodno je objavljeno da ponavljanja spidroina i QD-ovi, za koje se čini da prolaze kroz promjenu β-listova tijekom predenja svile, tvore hidrogelove.U usporedbi s našim nalazima, vremena inkubacije i/ili temperature inkubacije bile su znatno dulje ili više, a dobiveni hidrogelovi često su bili neprozirni (Slika 7 i Dodatna tablica 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Osim brzog vremena geliranja, NT hidrogelovi >300 mg/mL (30%) nadmašili su sve druge opisane rekombinantne hidrogelove proteina paukove svile, kao i prirodne hidrogelove kao što su želatina, alginat (2%), agar (0,5% ) i kolagen.(0,6%) (Slika 7 i dopunske tablice 1 i 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Vrijeme geliranja i modul elastičnosti hidrogelova u ovoj studiji uspoređeni su s drugim hidrogelovima na bazi spidroina i odabranim prirodnim hidrogelovima.Reference su dane zajedno s opisom uvjeta geliranja.APS Amonijev persulfat, sobna temperatura.Podaci 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Čini se da su pauci razvili načine za sprječavanje želiranja spidroina tijekom skladištenja.Unatoč visokoj koncentraciji proteina u svilenoj žlijezdi, veliko područje ponavljanja povezano s terminalnom domenom znači da prividna koncentracija NT i CT u žlijezdi odgovara približno 10-20 mg/ml, na granici ove studije.potreban za in vitro promatrano stvaranje hidrogela.Osim toga, slične koncentracije soli 16 stabilizirale su NT, kao u žlijezdama svile (Sl. 5b).NT konformacija proučavana je u citosolu E. coli i utvrđeno je da je čvršće savijena nego kada se ispituje in vitro, što dodatno ukazuje da sol ili drugi čimbenici sprječavaju njegovu agregaciju in vivo.Međutim, sposobnost NT da se transformiraju u fibrile β-lista može biti važna za formiranje filamenta i trebalo bi je istražiti u budućim studijama.
Uz nove aspekte formiranja fibrila i hidrogela nalik NT-amiloidu koji su uočeni u ovoj studiji, također pokazujemo da ovaj fenomen može imati biotehnološke i biomedicinske primjene (Slika 8).Kao dokaz koncepta, kombinirali smo NT s GFP ili PNP i pokazali da fuzijski protein također stvara hidrogelove kada se inkubira na 37 °C i da GFP i PNP frakcije u velikoj mjeri zadržavaju svoju aktivnost nakon geliranja (Slika 6).Nukleozidne fosforilaze važni su katalizatori sinteze nukleozidnih analoga75, što naše otkriće čini relevantnim za biofarmaceutsku industriju.Koncept ekspresije fuzijskih proteina koji tvore prozirne hidrogelove pod povoljnim uvjetima omogućuje stvaranje funkcionaliziranih hidrogelova s ​​povoljnim svojstvima za širok raspon primjena kao što je imobilizacija enzima, kontrolirano otpuštanje lijeka i inženjerstvo tkiva.Osim toga, NT i NT* učinkoviti su markeri ekspresije30, što znači da se NT i njegove varijante mogu koristiti za visokoproduktivnu proizvodnju topljivih fuzijskih proteina i naknadno stvaranje imobiliziranih ciljnih proteina u 3D hidrogelovima.
NT je topiv, α-spiralan i stabilan pri niskim koncentracijama (µM) i 37°C.Na istoj temperaturi, ali pri rastućim koncentracijama (>10 mg/ml), NT stvara gelove koji se sastoje od fibrila sličnih amiloidu.NT fuzijski proteini također tvore fibrilarne gelove s potpuno funkcionalnim fuzijskim fragmentima, omogućujući različitim proteinima da budu imobilizirani u 3D hidrogelovima pomoću NT.Dolje: NT (PDB: 4FBS) i ilustracije mreža vlakana i povezanih proteinskih struktura (pretpostavljeno i nije nacrtano u mjerilu, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Konstrukti (vidi dodatnu tablicu 4 za potpuni popis uključujući sekvence aminokiselina) su klonirani u plazmid pT7 i transformirani u E. coli BL21 (DE3).E. coli koji sadrži modificirane plazmide inokulirani su u Luria bujon s dodatkom kanamicina (70 mg/l) i uzgajani preko noći na 30°C i 250 okretaja u minuti.Kultura je zatim inokulirana 1/100 u LB medij koji je sadržavao kanamicin i uzgajana na 30°C i 110 okretaja u minuti dok OD600 nije dosegao 0,8.Za NMR istraživanja, bakterije su uzgajane u M9 minimalnom mediju koji je sadržavao 2 g D-glukoze 13C (Aldrich) i 1 g amonijevog klorida 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) za označavanje proteina izotopima.Snizite temperaturu na 20 stupnjeva Celzijusa i inducirajte ekspresiju proteina s 0,15 mM izopropiltiogalaktopiranozida (konačna koncentracija).Nakon prekonoćne ekspresije proteina, stanice su sakupljene na 7278 x g, 4°C tijekom 20 minuta.Stanični peleti su resuspendirani u 20 mM Tris-HCl, pH 8, i zamrznuti do daljnje upotrebe.Otopljene stanice lizirane su uporabom disruptora stanica (strojevi serije TS, Constant Systems Limited, Engleska) pri 30 kPa.Zatim su lizati centrifugirani na 25.000 g 30 minuta na 4°C.Za NTMiSp, talog je zatim resuspendiran u 2 M uree, 20 mM Tris-HCl, pH 8, i sonikiran 2 minute (2 s uključeno/isključeno, 65%), zatim ponovo centrifugiran na 25,000 xg, 4°C unutar 30 min.Supernatant je stavljen na Ni-NTA kolonu, ispran s 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazola, pH 8, i na kraju je protein eluiran s 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazola, pH 8. Za generiranje NT2RepCT i NTCT, digestija trombinom uvodi mjesto (ThrCleav) između Hisa i NT.Mjesta cijepanja trombina također su prisutna u His-NT-ThrCleav-2Rep (proizvodi 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (proizvodi NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (proizvodi CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (proizvodi NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (proizvodi NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (proizvodi NTF1Sp) i His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (proizvodi NTMiSp).Konstrukti su digestirani s trombinom (1:1000) i dijalizirani preko noći na 4°C s 20 mM Tris-HCl, pH 8, koristeći Spectra/Por membranu za dijalizu s pragom molekularne težine od 6-8 kDa.Nakon dijalize, otopina se nanosi na Ni-NTA kolonu i skuplja se efluent koji sadrži protein od interesa.Koncentracije proteina određene su mjerenjem UV apsorbancije na 280 nm korištenjem koeficijenta ekstinkcije svakog proteina, osim za NTF1Sp, koji je koristio Bradfordov test prema protokolu proizvođača.Čistoća je određena SDS poliakrilamidnom (4-20%) gel elektroforezom i bojanjem Coomassie brilliant blue.Proteini su koncentrirani korištenjem filtera za centrifugiranje (VivaSpin 20, GE Healthcare) na 4000 xg s prekidom od 10 kDa molekularne težine u ciklusima od 20 minuta.
Odmrznite otopinu proteina i pažljivo pipetirajte 150 µl u prozirnu bočicu od 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Epruvete su zatvorene i zapečaćene parafilmom kako bi se spriječilo isparavanje.Uzorci (n = 3) su inkubirani na 37°C ili 60°C i povremeno preokrenuti da se promatra geliranje.Uzorci koji nisu postali gel inkubirani su najmanje tjedan dana.Smanjite NTMiSp disulfidne veze s 10 mM DTT po 10 µM proteina.Za analizu geliranja prirodnih prevlaka od paukove svile, pauk švedski most je odrezan, dvije glavne žlijezde s ampulom stavljene su u 200 μl 20 mM Tris-HCl pufera pH 8 i odrezane kako bi se omogućilo da se prevlaka odvoji od žlijezda..Sadržaj žlijezda se otopi u puferu, 50 µl za određivanje suhe težine (inkubacijom otvorenih bočica na 60 °C do konstantne težine) i 150 µl za geliranje na 37 °C.
Mjerna geometrija/alat izrađen je od nehrđajućeg čelika pomoću paralelne ploče s gornjim promjerom od 20 mm i razmakom od 0,5 mm.Zagrijte uzorak s 25 °C na 45 °C i natrag na 25 °C brzinom od 1 °C u minuti pomoću Peltierove ploče od nehrđajućeg čelika.Mjerenja vibracija provedena su na frekvenciji od 0,1 Hz iu linearnom viskoelastičnom području materijala pri deformaciji od 5% i 0,5% za uzorke od 100 mg/mL odnosno 300-500 mg/mL.Koristite prilagođenu komoru za vlažnost kako biste spriječili isparavanje.Podaci su analizirani pomoću Prism 9.
Za prikupljanje infracrvenih (IR) spektara na sobnoj temperaturi od 800 do 3900 cm–1.ATR uređaj, kao i put svjetlosti kroz spektrometar, pročišćavaju se suhim filtriranim zrakom prije i tijekom eksperimenta.Otopine (500 mg/mL kako bi se smanjili vrhovi apsorpcije vode u spektrima) pipetirane su na kristale, a gelovi (500 mg/mL) su formirani prije mjerenja i zatim prebačeni u kristale (n = 3).Snimljeno je 1000 skeniranja s rezolucijom od 2 cm-1 i nultim radnim ciklusom od 2. Druga derivacija je izračunata korištenjem OPUS-a (Bruker) korištenjem raspona izravnavanja od devet točaka.Spektri su normalizirani na isto integracijsko područje između 1720 i 1580 cm-1 koristeći F. Menges "Spectragryph – softver za optičku spektroskopiju".U ATR-IR spektroskopiji, dubina prodiranja infracrvene zrake u uzorak ovisi o valnom broju, što rezultira jačom apsorpcijom pri nižim nego pri višim valnim brojevima.Ovi učinci nisu ispravljeni za spektre prikazane na sl.3 jer su vrlo male (dopunska slika 4).Korigirani spektri za ovu sliku izračunati su korištenjem softvera Bruker OPUS.
U načelu, sveobuhvatna kvantifikacija konformacija proteina moguća je nakon pouzdane dekonvolucije komponenata unutar vrha amida I.Međutim, u praksi se javljaju neke prepreke.Šum u spektru može se pojaviti kao (lažni) vrhunac tijekom dekonvolucije.Osim toga, vrh zbog savijanja vode podudara se s položajem vrha amida I i može imati sličnu veličinu za uzorke koji sadrže veliku količinu vode, kao što je ovdje proučavani vodeni gel.Stoga nismo pokušali potpuno razgraditi vrh amida I, a naša opažanja treba uzeti u obzir samo kao podršku drugim metodama kao što je NMR spektroskopija.
Otopine od 50 mg/ml NT i His-NT2RepCT su gelirane preko noći na 37°C.Hidrogel je zatim razrijeđen s 20 mM Tris-HCl (pH 8) do koncentracije od 12,5 mg/ml, dobro protresen i pipetiran da se razbije gel.Zatim je hidrogel razrijeđen 10 puta s 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl uzorka naneseno je na bakrenu rešetku presvučenu formvarom, a višak uzorka uklonjen upijajućim papirom.Uzorci su isprani dva puta s 5 µl MilliQ vode i obojeni s 1% uranil formatom 5 minuta.Uklonite višak mrlje upijajućim papirom, a zatim osušite mrežicu na zraku.Snimanje je obavljeno na ovim mrežama korištenjem FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN koji radi na 100 kV.Slike su snimljene pri x 26 500 i x 43 000 povećanja pomoću Veleta 2k × 2k CCD kamere (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Njemačka).Za svaki uzorak (n = 1) snimljeno je 10-15 slika.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) korišten je za analizu slike i mjerenje promjera vlakana (n = 100, različita vlakna).Prizma 9 korištena je za izvođenje neparnih t-testova (dvosmjerni).Prosječna vrijednost His-NT2RepCT i NT fibrila bila je 11,43 (SD 2,035) odnosno 7,67 (SD 1,389) nm.Interval pouzdanosti (95%) je od -4,246 do -3,275.stupnjevi slobode = 198, p < 0,0001.
80 µl tekućih uzoraka koji sadrže 10 µM tioflavina T (ThT) izmjereno je u triplikatu (n = 3) pod statičkim uvjetima korištenjem Corning ploča s 96 jažica s crnim dnom i prozirnim dnom (Corning Glass 3881, SAD).Razlike u fluorescenciji zabilježene su pomoću 440 nm ekscitacijskog filtra i 480 nm emisijskog filtra (FLUOStar Galaxy iz BMG Labtech, Offenburg, Njemačka).ThT signal nije bio ni zasićen niti ugašen, jer su pokusi s različitim koncentracijama ThT izvedeni bez promjene intenziteta signala.Zabilježite apsorbanciju na 360 nm za mjerenje zamagljenosti.Za pokuse nasađivanja, gelovi od 100 mg/mL formirani su na 37°C, resuspendirani i korišteni za nasađivanje u molarnim omjerima od 5%, 10% i 20%.Podaci su analizirani pomoću Prism 9.
Otopite zalihe His-NT2RepCT i NT >100 mg/mL na ledu i filtrirajte kroz filter od 0,22 µm.Koncentracije su izračunate mjerenjem apsorbancije na 280 nm pomoću Nanodrop-a.U jažicama crne nevezujuće ploče s 96 jažica (Corning) s prozirnim dnom uzorci su razrijeđeni do 20 mg/ml u 20 mM Tris-HCl pH 8 i pomiješani s 5 μM ThT (konačna koncentracija), ukupna koncentracija uzorka 50 μl volumena.Uzorci su snimani svakih 10 minuta na 37 °C na mikroskopu CellObserver (Zeiss) s kanalom propuštene svjetlosti i setovima FITC ekscitacijskih i emisijskih filtera za ThT snimanje.Za snimanje se koristi leća 20x/0,4.Za analizu slike korišteni su Zen Blue (Zeiss) i ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Gelovi su također pripravljeni iz otopina NT i His-NT2RepCT u koncentraciji od 50 mg/mL koje sadrže 20 mM Tris pH 8 i 5 µM ThT i inkubirani su na 37°C tijekom 90 minuta.Komadići gela prebačeni su u novu jažicu koja je sadržavala 20 mM Tris, pH 8 i 5 µM ThT u neobvezujućoj crnoj ploči s 96 jažica s prozirnim dnom.Dobijte slike zelene fluorescencije i svijetlog polja pri povećanju od 20x/0,4.Za analizu slike korišten je ImageJ.
NMR spektri otopine dobiveni su na 310 K na 600 MHz Bruker Avance Neo spektrometru opremljenom QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR uzorci koji sadrže 10 mg/mL homogenog proteina obilježenog s 13C, 15N, otopljenog u 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Kemijski pomaci NT2RepCT pri pH 6,7 korišteni su za dodjelu vrha 23 u 2D spektru 15N-HSQC.
Spektri NMR (MAS) 13C, 15N-označenih hidrogelova pod magičnim kutom rotacije snimljeni su na Bruker Avance III HD spektrometru na 800 MHz opremljenom 3,2 mm 13C/15N{1H} sondom bez elektrona.Temperatura uzorka kontrolirana je strujom plina promjenjive temperature na 277 K. Dvodimenzionalna dipolna rotacijska rezonancija (DARR)76 i radiofrekvencijska rekonekcija (RFDR)77 spektri dobiveni su na MAS frekvencijama od 12,5 kHz odnosno 20 kHz.Unakrsna polarizacija (CP) od 1H do 13C izvedena je korištenjem linearne rampe od 60,0 do 48,0 kHz na 1H, 61,3/71,6 kHz na 13C (na 12,5/20 kHz MAS) i vremena kontakta 0,5-1 ms.Tijekom prikupljanja podataka korišteno je spinalno6478 odvajanje na 73,5 kHz.Vrijeme prikupljanja bilo je 10 milisekundi, a odgoda ciklusa 2,5 sekunde.Jednostruko povezane Cα/Cβ korelacije uočene u RFDR spektrima dodijeljene su na temelju karakterističnih kemijskih pomaka tipa ostataka i višestruko povezanih korelacija u DARR spektrima.
Baza podataka Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) korištena je za procjenu tendencija lepršanja i Rosetta energije za NT, NTFlSp i NTMiSp.Baza podataka Zipper izračunava Rosetta Energy80, koja kombinira nekoliko funkcija slobodne energije za modeliranje i analizu strukture proteina.Energetska razina od -23 kcal/mol ili niža ukazuje na visoku sklonost fibrilaciji.Niža energija znači veću stabilnost dva β-lanca u konformaciji zatvarača.Osim toga, Waltzov algoritam korišten je za predviđanje amiloidogenih regija u NT, NTFlSp i NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Otopina NT proteina pomiješana je s puferom 2-(N-morfolino)etansulfonske kiseline (MES) pri pH 5,5 i 6,0 kako bi se pH spustio na pH 6, odnosno 7.Konačna koncentracija proteina bila je 100 mg/ml.
Mjerenja su obavljena na spektrometru J-1500 CD (JASCO, SAD) pomoću kivete od 300 μL s optičkim putem od 0,1 cm.Proteini su razrijeđeni do 10 μM (n = 1) u 20 mM fosfatnom puferu (pH 8).Za analizu stabilnosti proteina u prisutnosti soli, proteini su analizirani pri istoj koncentraciji (n = 1) u 20 mM fosfatnom puferu (pH 8) koji sadrži 154 mM NaF odnosno NaCl.Skeniranja temperature su zabilježena na 222 nm od 25°C do 95°C uz brzinu zagrijavanja od 1°C/min.Udio prirodno savijenih proteina izračunat je pomoću formule (KDmjera – KDfinale)/(KDstart – KDfinale).Osim toga, snimljeno je pet spektara za svaki uzorak od 260 nm do 190 nm na 25°C i nakon zagrijavanja na 95°C.Pet spektara je usrednjeno, izglađeno i pretvoreno u molarnu eliptičnost.Podaci su analizirani pomoću Prism 9.
Intenzitet fluorescencije His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) mjeren je u triplikatu (n = 3) u Corning pločama s 96 jažica s crnim prozirnim dnom (Corning Glass 3881, SAD) u statičkim uvjetima.Izmjerite uzorke fluorescentnim čitačem ploča s valnom duljinom ekscitacije od 395 nm i zabilježite emisiju na 509 nm prije geliranja i 2 sata kasnije na 37°C.Podaci su analizirani s Prismom 9.
Komplet za ispitivanje aktivnosti purin nukleozid fosforilaze (fluorometrijska metoda, Sigma Aldrich) korišten je prema uputama proizvođača.Za mjerenje aktivnosti u gelovima i otopinama koje sadrže His-NT-PNP, pomiješajte 10 ng His-NT-PNP sa 100 mg/mL NT do ukupnog volumena od 2 µL jer je gel dao signal iznad intervala detekcije skupa.Uključene su kontrole za gelove i otopine bez His-NT-PNP.Mjerenja su provedena dva puta (n = 2).Nakon mjerenja aktivnosti, reakcijska smjesa je uklonjena i gel je fotografiran kako bi se osiguralo da je gel ostao netaknut tijekom mjerenja.Podaci su analizirani pomoću Prism 9.
Za više informacija o dizajnu studije pogledajte sažetak studije prirode povezan s ovim člankom.
Na slikama 1 i 2 prikazani su početni podaci.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f i 6, dodatne slike.3, dodatna sl.5a, d, dodatna sl.6 i dodatna sl.8. Podaci Podaci iz ove studije nalaze se u Zenodo bazi podataka https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.NMR podaci dobiveni u ovoj studiji objavljeni su u BMRBig repozitoriju pod unosom ID bmrbig36.Strukture GFP i PNP preuzete su iz PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. i Johansson, J. Predenje umjetne paukove svile.National Chemical.biologija.11, 309–315 (2015).
Babb, PL i sur.Genom Nephila clavipes naglašava raznolikost gena paukove svile i njihovu složenu ekspresiju.Nacionalni Genette.49, 895–903 (2017).