347 12,7*1,24 mm Zavojna cijev od nehrđajućeg čelika, Molekularni mehanizam sinkrone elektrostatske kondenzacije i koagregacije α-sinukleina i tau

Hvala što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, web stranicu prikazujemo bez stilova i JavaScripta.
Klizači koji prikazuju tri članka po slajdu.Za pomicanje kroz slajdove koristite gumbe Natrag i Sljedeće ili gumbe za upravljanje slajdovima na kraju za kretanje kroz svaki slajd.

Specifikacija cijevi od nehrđajućeg čelika 347

347 12,7*1,24 mm Namotana cijev od nehrđajućeg čelika

Vanjski promjer: 6,00 mm OD do 914,4 mm OD, Veličine do 24” NB dostupno na zalihama, čelične cijevi OD veličine dostupne na zalihama

SS 347 Raspon debljine cijevi: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, itd. (0,5-12 mm) Ili neuobičajena veličina koja se kroji po potrebi

Tip: SS 347 Bešavne cijevi |SS 347 ERW cijevi |SS 347 Šavne cijevi |SS 347 Fabricirane cijevi |SS 347 CDW cijevi, LSAW cijevi / zavarene šavovima / ponovno nacrtane

Oblik: SS 347 okrugle cijevi/cijevi, SS 347 kvadratne cijevi/cijevi, SS 347 pravokutne cijevi/cijevi, SS 347 namotane cijevi, SS 347 "U" oblik, SS 347 Pan Cake namotaji, SS 347 hidraulične cijevi

Duljina: Jednostruka nasumična, Dvostruka nasumična i potrebna duljina Kraj: Ravni kraj, Ukošeni kraj, s gazištima

Krajnja zaštita: plastični čepovi |Vanjska završna obrada: 2B, br. 4, br. 1, br. 8 zrcalna završna obrada za cijevi od nehrđajućeg čelika, završna obrada prema zahtjevima kupca

Uvjeti isporuke: žareno i dekapirano, polirano, žareno žareno, hladno vučeno

Inspekcija, Izvješća o ispitivanju: Potvrde o ispitivanju mlina, EN 10204 3.1, Izvješća o kemikalijama, Izvješća o mehanici, Izvješća o PMI ispitivanjima, Izvješća o vizualnoj inspekciji, Izvješća o inspekciji treće strane, Izvješća laboratorija odobrena od NABL-a, Izvješća o ispitivanju razaranja, Izvješća o ispitivanju bez razaranja

Pakiranje: pakirano u drvene kutije, plastične vrećice, čelične trake u paketu ili prema zahtjevima kupaca

Posebnosti: Veličine i specifikacije osim gore navedenih mogu se proizvesti na zahtjev

SS 347 Raspon veličina cijevi: 1/2 inča NB, OD do 24 inča

ASTM A312 347: Bešavne i ravne zavarene austenitne cijevi namijenjene za rad na visokim temperaturama i općoj koroziji.Dodatni metal nije dopušten tijekom zavarivanja.

ASTM A358 347: Električno zavarena austenitna cijev za korozivne i/ili visoke temperature.Obično se prema ovoj specifikaciji proizvode samo cijevi do 8 inča.Tijekom zavarivanja dopušteno je dodavanje dodatnog metala.

ASTM A790 347: Bešavne i ravne zavarene feritne/austenitne (duplex) cijevi namijenjene za opću korozivnu upotrebu, s posebnim naglaskom na otpornost na pucanje od korozije pod naponom.

ASTM A409 347: Ravno ili spiralno zavarena elektrofuziono zavarena austenitna lagana cijev velikog promjera u veličinama od 14” do 30” sa stijenkama Sch5S i Sch 10S za korozivne i/ili visoke

ASTM A376 347: Bešavna austenitna cijev za primjenu na visokim temperaturama.

ASTM A813 347: Austenitna cijev s jednim šavom, jednostruko ili dvostruko zavarena za visokotemperaturne i opće korozivne primjene.

ASTM A814 347: Hladno obrađena zavarena austenitna cijev za visoke temperature i opću korozivnu upotrebu.

Kemijski sastav cijevi od nehrđajućeg čelika 347H

Mehanička svojstva cijevi od nehrđajućeg čelika 347H

Fizička svojstva cijevi od nehrđajućeg čelika 347H

Ekvivalentni stupnjevi za cijevi od nehrđajućeg čelika 347H

Amiloid alfa-sinuklein (αS) agregacija je obilježje Parkinsonove bolesti i drugih sinukleinopatija.Nedavno je tau protein koji se obično povezuje s Alzheimerovom bolešću povezan s αS patologijom i otkriveno je da se ko-lokalizira u inkluzijama bogatim αS, iako molekularni mehanizam koagregacije dvaju proteina ostaje nejasan.Ovdje izvješćujemo da se αS faza razdvaja u tekuće kondenzate elektrostatskom kompleksnom kondenzacijom s pozitivno nabijenim polipeptidima kao što je tau.Ovisno o afinitetu αS za polikatione i brzini smanjenja valencije koagulacijske mreže, ugrušci prolaze kroz brzu gelaciju ili koalescenciju nakon čega slijedi spora agregacija amiloida.Kombinacijom skupa naprednih biofizičkih tehnika uspjeli smo karakterizirati odvajanje αS/Tau faze tekućina-tekućina i identificirati ključne čimbenike koji dovode do stvaranja heterogenih agregata koji sadrže oba proteina u tekućem proteinskom kondenzatu.
Osim membranskih odjeljaka, prostorno odvajanje u stanicama također se može postići stvaranjem proteinima bogatih, tekućina sličnih gustih tijela zvanih biomolekularni kondenzati ili kapljice, kroz proces poznat kao odvajanje faze tekućina-tekućina (LLPS).Ove kapljice nastaju multivalentnim vremenskim interakcijama, obično između proteina ili proteina i RNK, i služe različitim funkcijama u gotovo svim živim sustavima.Velik broj proteina sposobnih za LLP pokazuje sekvence niske složenosti koje su po prirodi vrlo poremećene i u formiranju biomolekularnih kondenzata3,4,5.Brojne eksperimentalne studije otkrile su fleksibilnu, često neuređenu i viševalentnu prirodu proteina koji čine te kondenzate nalik tekućini, iako se malo zna o specifičnim molekularnim determinantama koje kontroliraju rast i sazrijevanje ovih kondenzata u više čvrste država..
Novi podaci podupiru hipotezu da aberantni proteinski LLPS i transformacija kapljica u čvrste strukture mogu biti relevantni stanički putevi koji dovode do stvaranja netopivih toksičnih agregata koji su često obilježja degenerativnih bolesti.Mnogi intrinzično poremećeni proteini (IDP) povezani s LLPS-om, često visoko nabijeni i fleksibilni, dugo su bili povezani s neurodegeneracijom kroz proces agregacije amiloida.Konkretno, pokazalo se da biomolekularni IDP kondenzati kao što su FUS7 ili TDP-438 ili proteini s velikim domenama niske složenosti kao što je hnRNPA19 stare u gelaste ili čak čvrste oblike kroz proces koji se naziva fluidizacija.spoj.na prijelaz čvrste faze (LSPT) kao funkciju vremena ili kao odgovor na određene post-translacijske modifikacije ili patološki značajne mutacije1,7.
Još jedan IDP povezan s LLPS in vivo je Tau, poremećeni protein povezan s mikrotubulama čija je agregacija amiloida implicirana u Alzheimerovoj bolesti10, ali je nedavno također upletena u Parkinsonovu bolest (PD) i druge sinaptičke nuklearne proteinopatije 11, 12, 13 su povezane.Pokazalo se da Tau spontano disocira iz otopine/citoplazme zbog povoljnih elektrostatskih interakcija14, što rezultira stvaranjem kapljica obogaćenih tauom poznatih kao elektrostatski koacervati.Također je primijećeno da je ova vrsta nespecifične interakcije pokretačka snaga iza mnogih biomolekularnih kondenzata u prirodi15.U slučaju tau proteina, elektrostatska agregacija može nastati jednostavnom agregacijom, u kojoj suprotno nabijena područja proteina pokreću proces cijepanja, ili složenom agregacijom kroz interakciju s negativno nabijenim polimerima kao što je RNA.
Nedavno je α-sinuklein (αS), amiloidni IDP uključen u PD i druge neurodegenerativne bolesti zajednički poznate kao sinukleinopatija17,18, dokazan u staničnim i životinjskim modelima19,20 koncentriran u proteinskim kondenzatima s ponašanjem sličnim tekućini.Studije in vitro pokazale su da αS prolazi kroz LLPS jednostavnom agregacijom kroz pretežno hidrofobne interakcije, iako ovaj proces zahtijeva iznimno visoke koncentracije proteina i netipično duga vremena inkubacije19,21.Ostaje ključno neriješeno pitanje nastaju li kondenzati koji sadrže αS promatrani in vivo ovim ili drugim LLPS procesima.Slično tome, iako je agregacija amiloida αS primijećena u neuronima kod PD-a i drugih sinukleinopatija, točan mehanizam kojim αS prolazi unutarstaničnu agregaciju amiloida ostaje nejasan, budući da se čini da prekomjerna ekspresija ovog proteina sama po sebi ne pokreće ovaj proces.Često je potrebno dodatno stanično oštećenje, što sugerira da su određena stanična mjesta ili mikrookruženja potrebna za renukleaciju unutarstaničnih sklopova amiloida αS.Jedno stanično okruženje koje je posebno sklono agregaciji može biti unutrašnjost proteinskih kondenzata 23 .
Zanimljivo, otkriveno je da se αS i tau zajedno lokaliziraju u karakterističnim inkluzijama bolesti kod ljudi s Parkinsonovom bolešću i drugim sinukleinopatijama 24,25, a eksperimenti su izvijestili o sinergističkom patološkom odnosu između ta dva proteina 26,27 što ukazuje na potencijalni odnos između agregacije αS i tau kod neurodegenerativnih bolesti.bolest.Utvrđeno je da αS i tau međusobno djeluju i potiču međusobnu agregaciju in vitro i in vivo 28,29, a heterogeni agregati sastavljeni od ova dva proteina uočeni su u mozgovima pacijenata sa sinukleinopatijama 30 .Međutim, malo se zna o molekularnoj osnovi interakcije između αS i tau i mehanizmu njegove koagregacije.Zabilježeno je da αS stupa u interakciju s tau putem elektrostatskog privlačenja između visoko negativno nabijenog C-terminalnog područja αS i središnjeg područja tau bogatog prolinom, koje je također obogaćeno pozitivno nabijenim ostacima.
U ovoj studiji pokazujemo da se αS doista može disocirati u kapljice putem elektrostatske kondenzacije kompleksa u prisutnosti tau proteina, za razliku od njegove interakcije s drugim pozitivno nabijenim polipeptidima kao što je poli-L-lizin (pLK), i u ovom procesu .αS djeluje kao molekula skele za mrežu kapljica.Identificirali smo zamjetne razlike u procesu sazrijevanja elektrostatskih αS koacervata, koje su povezane s razlikama u valenciji i snazi ​​međudjelovanja proteina uključenih u koacervatnu mrežu.Zanimljivo je da smo promatrali koagregaciju αS i tau amiloidnih proteina u dugoživućim tekućim koacervatima i identificirali neke ključne čimbenike koji dovode do koagregacije ova dva proteina u takvim koacervatima.Ovdje detaljno opisujemo ovaj proces, koji je mogući molekularni mehanizam u podlozi kolokalizacije dvaju proteina u inkluzijama specifičnim za bolest.
αS ima visoko anionski C-terminalni rep pri neutralnom pH (Sl. 1a) i pretpostavili smo da bi mogao biti podvrgnut LLPS-u kroz kondenzaciju elektrostatskih kompleksa s polikationskim poremećenim polipeptidnim molekulama.Koristili smo poli-L-lizin (pLK) od 100 ostataka kao polaznu modelnu molekulu zbog njegove pozitivno nabijene i neuredne polimerne prirode pri neutralnom pH 32. Prvo smo potvrdili da pLK stupa u interakciju s Ct domenom αS pomoću NMR spektroskopije otopine (Slika 1b) pomoću 13C/15N-označenog αS u prisutnosti rastućih molarnih omjera αS:pLK.Interakcija pLK s Ct-domenom αS očituje se u perturbacijama kemijskog pomaka i smanjenju intenziteta vrha u ovoj regiji proteina.Zanimljivo, kada smo pomiješali αS s pLK pri koncentraciji αS od cca.5–25 µM u prisutnosti polietilen glikola (5–15% PEG-8) (tipični LLPS pufer: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) odmah smo prošli kroz široko polje stvaranja proteina .kapljice su opažene pomoću fluorescentne (WF) i mikroskopije svijetlog polja (BF) (slika 1c).Kapljice od 1-5 µm koje sadrže koncentrirani αS (dodan 1 µM AlexaFluor488-označen αS, AF488-αS), njihova elektrostatska svojstva mogu se izvesti iz njihove otpornosti na 10% 1,6-heksandiola (1,6-HD) i njegove osjetljivosti na povećanje koncentracije NaCl (slika 1c).Tekućinska priroda koacervata αS/pLK elektrostatskog kompleksa prikazana je njihovom sposobnošću spajanja unutar milisekundi (slika 1d).Koristeći turbidimetriju, kvantificirali smo stvaranje kapljica pod tim uvjetima, potvrdili elektrostatsku prirodu glavne interakcije povezane s njegovom stabilnošću (Slika 1e) i procijenili učinak različitih omjera polimera na LLPS proces (Slika 1f).Iako se stvaranje kapljica opaža u širokom rasponu omjera polimera, proces je vrlo povoljan kada je pLK veći od αS.LLP-ovi su također primijećeni korištenjem kemijski različitog sredstva za istiskivanje dekstrana-70 (70 kDa) ili korištenjem različitih formata uzoraka, uključujući staklene stakalce, jažice mikropločica od različitih materijala, Eppendorf ili kvarcne kapilare.
Shematski prikaz različitih proteinskih regija u varijantama WT-αS i ΔCt-αS korištenim u ovoj studiji.Amfipatska N-terminalna domena, hidrofobna regija koja stvara amiloid (NAC) i negativno nabijena C-terminalna domena prikazane su plavom, narančastom i crvenom bojom.Prikazana je karta neto naknade po ostatku (NCPR) za WT-αS.b NMR analiza αS/pLK interakcije u odsutnosti makromolekularnih nakupina.Kako se koncentracija pLK povećava (molarni omjeri αS:pLK od 1:0,5, 1:1,5 i 1:10 prikazani su svijetlozelenom, zelenom i tamnozelenom bojom).c Koacervat αS/pLK (molarni omjer 1:10) na 25 µM (1 µM AF488-označen αS ili Atto647N-označen pLK za WF snimanje) u LLPS puferu (gore) ili dopunjen s 500 mM NaCl (dolje lijevo) ili nakon 10 % 1,6-heksandiol (1,6-HD; dolje desno).Mjerna traka = 20 µm.d Reprezentativne mikroskopske slike BF fuzije kapljica αS/pLK (molarni omjer 1:10) pri koncentraciji od 25 μM;strelice označavaju spajanje pojedinačnih kapi (crvene i žute strelice) u novu kap (narančasta strelica) unutar 200 ms).Mjerna traka = 20 µm.e Raspršenje svjetlosti (na 350 nm) αS/pLK agregacija u LLPS puferu prije i nakon dodatka 500 mM NaCl ili 10% 1,6-HD na 25 µM αS (N = 3 ponavljanja uzorka, također su naznačene srednja vrijednost i standardna devijacija).f BF slika (gore) i analiza raspršenja svjetlosti (na 350 nm, dolje) agregacije αS/pLK na 25 μM αS s povećanjem molarnog omjera αS:pLK (N = 3 ponavljanja uzorka, također su naznačene srednja vrijednost i standardna devijacija).Mjerna traka = 10 µm.Traka mjerila na jednoj slici označava mjerilo svih slika na jednoj ploči.Neobrađeni podaci daju se u obliku datoteka neobrađenih podataka.
Na temelju naših opažanja kondenzacije elektrostatskog kompleksa αS/pLK i prethodnih opažanja αS kao klijentske molekule tau/RNA kondenzata kroz izravnu interakciju s tau31, pretpostavili smo da bi se αS i tau mogli ko-segregirati s otapalom u odsutnosti RNA kondenzacija.kroz elektrostatske komplekse, a αS je protein skele u αS/Tau koacervatima (vidi raspodjelu naboja tau na slici 2e).Primijetili smo da kada se 10 µM αS i 10 µM Tau441 (sadrži 1 µM AF488-αS i 1 µM Atto647N-Tau, respektivno) pomiješa u LLPS puferu, lako formiraju proteinske agregate koji sadrže oba proteina, kao što se vidi WF mikroskopijom.(slika 2a).Kolokalizacija dvaju proteina u kapljicama potvrđena je konfokalnom (CF) mikroskopijom (dopunska slika 1a).Slično ponašanje uočeno je kada je dekstran-70 korišten kao sredstvo za agregaciju (dodatna slika 1c).Koristeći bilo FITC-označeni PEG ili dekstran, otkrili smo da su oba sredstva za nakupljanje ravnomjerno raspoređena po uzorcima, ne pokazujući ni segregaciju ni povezanost (dodatna slika 1d).Umjesto toga, to sugerira da u ovom sustavu oni promiču razdvajanje faza kroz učinke makromolekularnog zgušnjavanja, budući da je PEG preferirano stabilan agens za zgušnjavanje, kao što se vidi u drugim LLP sustavima33,34.Ove kapljice bogate proteinima bile su osjetljive na NaCl (1 M), ali ne i na 1,6-HD (10% v/v), što potvrđuje njihova elektrostatska svojstva (dodatna slika 2a, b).Njihovo ponašanje tekućine potvrđeno je promatranjem milisekundnih događaja spajanja kapljica pomoću BF mikroskopije (slika 2b).
a Konfokalne (CF) mikroskopske slike koacervata αS/Tau441 u LLPS puferu (10 μM svakog proteina, 0,5 μM αS obilježenog AF488 i Tau441 obilježenog Atto647N).b Reprezentativne slike kontrasta diferencijalne interferencije (DIC) događaja fuzije kapljica αS/Tau441 (10 μM za svaki protein).c Fazni dijagram temeljen na raspršenju svjetlosti (na 350 nm) Tau441 LLPS (0-15 µM) u odsutnosti (lijevo) ili prisutnosti (desno) 50 µM αS.Toplije boje ukazuju na veću raspršenost.d Raspršenje svjetlosti αS/Tau441 LLPS uzoraka s povećanjem koncentracije αS (Tau441 pri 5 µM, N = 2-3 ponavljanja uzorka kao što je naznačeno).e Shematski prikaz nekih varijanti proteina tau i različitih regija proteina korištenih u ovoj studiji: negativno nabijena N-terminalna domena (crvena), regija bogata prolinom (plava), domena vezanja mikrotubula (MTBD, označeno narančastom) i parna spirala koja stvara amiloid.filamentne regije (PHF) smještene unutar MTBD (sivo).Prikazana je karta neto naknade po ostatku (NCPR) za Tau441.f Upotrebom 1 µM αS obilježenog AF488 i ΔNt- obilježenog Atto647N, upotrebom 1 µM αS ili ΔCt-αS obilježenog AF488 u prisutnosti ΔNt-Tau (gore, 10 µM po proteinu) ili K18 (dolje, 50 µM po proteinu) ) ) ) mikrofotografije WF kondenzirane u LLPS ili K18 puferu.Trake mjerila na jednoj slici predstavljaju mjerilo svih slika na jednoj ploči (20 µm za ploče a, b i f).Neobrađeni podaci za panele c i d dani su kao datoteke neobrađenih podataka.
Kako bismo testirali ulogu αS u ovom LLPS procesu, prvo smo istražili učinak αS na stabilnost kapljica nefelometrijom koristeći rastuće koncentracije NaCl (Slika 2c).Što je veća koncentracija soli u uzorcima koji sadrže αS, to su veće vrijednosti raspršenja svjetlosti (na 350 nm), što ukazuje na stabilizirajuću ulogu αS u ovom LLPS sustavu.Sličan učinak može se primijetiti povećanjem koncentracije αS (a time i omjera αS:Tau441) na pribl.10-struko povećanje u odnosu na koncentraciju tau (5 µM) (Sl. 2d).Kako bismo pokazali da je αS protein skele u koacervatima, odlučili smo istražiti ponašanje Tau mutanta poremećenog LLPS-om, kojem nedostaje negativno nabijena N-terminalna regija (ostaci 1-150, vidi sliku 2e) nazvana ΔNt-Tau.WF mikroskopija i nefelometrija potvrdile su da sam ΔNt-Tau nije bio podvrgnut LLPS-u (slika 2f i dopunska slika 2d), kao što je prethodno objavljeno 14. Međutim, kada je αS dodan disperzijskim otopinama ove skraćene Tau varijante, LLPS proces bio je potpuno obnovljen s gustoćom kapljica bliskom gustoći kapljica pune veličine otopina Tau i αS pod sličnim uvjetima i koncentracijama proteina.Ovaj se proces također može promatrati u uvjetima niske makromolekularne gužve (dodatna slika 2c).Uloga C-terminalne αS regije, ali ne cijele njezine duljine, u LLPS procesu dokazana je inhibicijom stvaranja kapljica korištenjem C-terminalne skraćene αS varijante kojoj nedostaju ostaci 104-140 (Sl. 1a) (ΔCt- αS) protein (Slika 2f i Dodatna slika 2d).Kolokalizacija αS i ΔNt-Tau potvrđena je konfokalnom fluorescentnom mikroskopijom (dopunska slika 1b).
Za daljnje testiranje mehanizma LLPS između Tau441 i αS, korištena je dodatna Tau varijanta, točnije upareni fragment jezgre spiralnog filamenta (PHF) u domeni vezanja mikrotubula (MTBD), koja ako sadrži četiri karakteristične ponovljene domene, općenito poznate kao fragment K18 (vidi sliku 2e).Nedavno je objavljeno da se αS prvenstveno veže na tau protein koji se nalazi u domeni bogatoj prolinom u sekvenci koja prethodi domeni vezanja mikrotubula.Međutim, PHF regija također je bogata pozitivno nabijenim ostacima (vidi sliku 2e), posebno lizinom (15% ostataka), što nas je potaknulo da testiramo doprinosi li ova regija i kondenzaciji αS/Tau kompleksa.Uočili smo da sam K18 ne može pokrenuti LLPS u koncentracijama do 100 µM u testiranim uvjetima (LLPS pufer s 15% PEG ili 20% dekstrana) (Slika 2f).Međutim, kada smo dodali 50 µM αS u 50 µM K18, nefelometrijom (dodatna slika 2d) i WF mikroskopijom (slika 2f) primijećeno je brzo stvaranje proteinskih kapljica koje sadrže K18 i αS.Kao što se i očekivalo, ΔCt-αS nije mogao obnoviti LLPS ponašanje K18 (slika 2f).Napominjemo da su za agregaciju αS/K18 potrebne malo veće koncentracije proteina za induciranje LLPS-a u usporedbi s αS/ΔNt-Tau ili αS/Tau441, ako su ostale stvari jednake.Ovo je u skladu s jačom interakcijom αS C-terminalne regije s Tau domenom bogatom prolinom u usporedbi s domenom koja veže mikrotubule, kao što je prethodno opisano 31 .
S obzirom na to da ΔNt-Tau ne može izvesti LLPS u nedostatku αS, odabrali smo ovu Tau varijantu kao model za karakterizaciju αS/Tau LLPS s obzirom na njegovu jednostavnost u LLPS sustavima s Tau punom dužinom (izotip, Tau441/Tau441).sa složenim (heterotipnim, αS/Tau441) procesima agregacije.Usporedili smo stupanj agregacije αS (kao dijela proteina kondenzirane faze, fαS,c) u sustavima αS/Tau i αS/ΔNt-Tau centrifugiranjem i SDS-PAGE analizom disperzne faze (vidi 2e), pronašli vrlo slične vrijednosti za sve proteine ​​u istoj koncentraciji.Konkretno, dobili smo fαS,c 84 ± 2% i 79 ± 7% za αS/Tau odnosno αS/ΔNt-Tau, što sugerira da je heterotipska interakcija između αS i tau superiornija od interakcije između tau molekula.između.
Interakcija s različitim polikationima i učinak procesa kondenzacije na kinetiku αS prvi su proučavani metodom oporavka fluorescencije nakon fotoizbjeljivanja (FRAP).Testirali smo αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau i αS/pLK koacervate (100 μM αS dopunjeno s 2 μM αS AF488-αS i 100 μM Tau441 ili ΔNt-Tau ili 1 mM pLK).Podaci su dobiveni unutar prvih 30 minuta nakon miješanja komponenti uzorka.Iz reprezentativnih FRAP slika (Slika 3a, kondenzacija αS/Tau441) i njihovih odgovarajućih krivulja vremenskog tijeka (Slika 3b, Dodatna slika 3), može se vidjeti da je kinetika αS vrlo slična kinetici koacervata Tau441.i ΔNt-Tau, koji je mnogo brži s pLK.Izračunati koeficijenti difuzije za αS unutar koacervata prema FRAP-u (kako su opisali Kang et al. 35) su D = 0,013 ± 0,009 µm2/s i D = 0,026 ± 0,008 µm2/s za αS/Tau441 i αS/ΔNt- za sustav αS/.pLK, Tau i D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, redom (slika 3c).Međutim, koeficijent difuzije αS u disperziranoj fazi je nekoliko redova veličine viši od svih kondenziranih faza, kako je utvrđeno fluorescentnom korelacijskom spektroskopijom (FCS, vidi dopunsku sliku 3) pod istim uvjetima (LLPS pufer), ali u odsutnosti polikationa (D = 8 ± 4 µm2/s).Zbog toga je kinetika αS translacije značajno smanjena u koacervatima u usporedbi s proteinima u disperziranoj fazi zbog izraženih učinaka molekularne gužve, iako svi koacervati zadržavaju svojstva slična tekućini tijekom prvih pola sata nakon formiranja, za razliku od tau faze.brža kinetika u pLK kondenzatu.
a–c FRAP analiza dinamike αS (2% αS obilježenog AF488) u elektrostatskim koacervatima.Reprezentativne slike αS/Tau441 FRAP testova u tri primjerka prikazane su u (a), gdje crveni krugovi označavaju obezbojena područja.Traka mjerila je 5 µm.b Prosječne FRAP krivulje i (c) izračunati koeficijenti difuzije (D) za 5-6 (N) različitih kapljica iz tri eksperimenta uz korištenje 100 µM αS i ekvimolarnih koncentracija Tau441 (crveno) ili ΔNt-Tau (plavo) ili pLK (zeleno) u deset puta većoj koncentraciji od LLPS.Standardna devijacija FRAP krivulje prikazana je zasjenjenom bojom.Za usporedbu, koeficijent difuzije αS u disperziranoj fazi određen je u tri primjerka korištenjem fluorescentne korelacijske spektroskopije (FCS) (pogledajte dodatnu sliku 3 i metode za više informacija).d Kontinuirani EPR spektar X-pojasa od 100 μM TEMPOL-122-αS u LLPS puferu bez polikationa (crno) ili u prisutnosti 100 μM Tau441 (crveno) ili ΔNt-Tau (plavo) ili 1 mM pLK (zeleno).Umetak prikazuje uvećani prikaz jakih linija polja gdje se događaju najdramatičnije promjene.e Krivulje vezanja 50 μM TEMPOL-122-αS s različitim polikationima u odsutnosti LLPS (bez PEG).Pokazalo se da smanjena amplituda vrpce III u usporedbi s vrpcom II (IIII/III) normaliziranog EPR spektra povećava molarne omjere Tau441 (crveno), ΔNt-Tau (plavo) i pLK (zeleno).Obojene linije pokazuju prilagodbu podacima korištenjem grubog modela vezivanja s n identičnih i neovisnih veznih mjesta na svakoj krivulji.Neobrađeni podaci daju se u obliku datoteka neobrađenih podataka.
Kao dopuna, istraživali smo dinamiku αS u različitim koacervatima korištenjem usmjerenog označavanja spina (SDSL) i kontinuirane elektronske paramagnetske rezonancije (CW-EPR).Ova se metoda pokazala vrlo korisnom u izvješćivanju o fleksibilnosti i dinamici IDP-a s realnom rezidualnom rezolucijom36,37,38.U tu smo svrhu konstruirali cisteinske ostatke u pojedinačnim Cys mutantima i upotrijebili 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksil (TEMPOL) spinsku sondu.Označavaju ih derivati ​​maleimida.Točnije, umetnuli smo TEMPOL sonde na poziciju 122 ili 24 αS (TEMPOL-122-αS i TEMPOL-24-αS).U prvom slučaju, ciljamo na C-terminalnu regiju proteina, koja je uključena u interakciju s polikationima.Umjesto toga, pozicija 24 može nam dati informacije o ukupnoj dinamici proteina u kondenzatu.U oba slučaja, EPR signali dobiveni za proteine ​​disperzne faze odgovarali su nitroksidnim radikalima u brzom pokretnom stanju.Nakon razdvajanja faza u prisutnosti tau ili pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ili ΔNt-Tau u omjeru 1:1 ili pLK u omjeru 1:10), primijećeno je povećanje relativnog vršnog intenziteta u EPR spektar αS.Linija gubitka se proširila, što ukazuje na smanjenu kinetiku preorijentacije αS u kapljicama u usporedbi s proteinom u razrijeđenoj fazi (Slika 3d, Dodatna slika 4a).Ove su promjene izraženije na položaju 122. Dok na položaju 24 prisutnost pLK nije utjecala na kinetiku sonde, na položaju 122 oblik spektralne linije značajno se promijenio (dodatna slika 4a).Kada smo pokušali modelirati spektre na poziciji 122 dva αS/polikation sustava koristeći izotropni model (dodatna slika 5a) koji se obično koristi za opisivanje dinamike spinom označenog IDP38,39, nismo uspjeli rekonstruirati eksperimentalne spektre..Spektralna simulacija položaja kontrasta 24 spina (dodatna slika 5a).Ovo sugerira da postoje preferencijalni položaji u prostoru spinskih konfiguracija C-terminalne regije αS u prisutnosti polikationa.Pri razmatranju udjela αS u kondenziranoj fazi pod eksperimentalnim EPR uvjetima (84 ± 2%, 79 ± 7% i 47 ± 4% za αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, odnosno αS/pLK—pogledajte dopunu Slika 2e analize podataka c), može se vidjeti da proširenje otkriveno EPR metodom uglavnom odražava interakciju C-terminalne regije αS s različitim polikationima u kondenziranoj fazi (glavna promjena kada se koristi TEMPOL-122- αS), a ne kondenzacija proteina.U sondi se opaža povećanje mikroviskoznosti.Kao što se očekivalo, EPR spektar proteina u uvjetima različitim od LLPS bio je potpuno obnovljen kada je u smjesu dodan 1 M NaCl (dodatna slika 4b).Sveukupno, naši podaci sugeriraju da promjene koje je detektirao CW-EPR uglavnom odražavaju interakciju C-terminalne regije αS s različitim polikationima u kondenziranoj fazi, a čini se da je ova interakcija jača s pLK nego s Tau.
Kako bismo dobili više strukturnih informacija o proteinima u koacervatu, odlučili smo proučiti LLPS sustav koristeći NMR u otopini.Međutim, mogli smo detektirati samo αS frakciju koja je ostala u disperziranoj fazi, što može biti posljedica smanjene dinamike proteina unutar koacervata i guste faze na dnu otopine u NMR analizi.Kada smo analizirali strukturu i dinamiku proteina koji je ostao u disperziranoj fazi uzorka LLPS koristeći NMR (dodatna slika 5c, d), primijetili smo da se protein ponašao gotovo identično u prisutnosti pLK i ΔNt-Tau, oba od koje su bile u sekundarnoj strukturi i dinamici proteinske okosnice, otkrivene eksperimentima na sekundarnom kemijskom pomaku i relaksaciji R1ρ.NMR podaci pokazuju da C-završetak αS trpi značajan gubitak konformacijske fleksibilnosti dok zadržava svoju poremećenu prirodu, kao i ostatak proteinske sekvence, zbog svojih interakcija s polikationima.
Budući da širenje CW-EPR signala opaženo u kondenziranoj fazi TEMPOL-122-αS odražava interakciju proteina s polikationima, izvršili smo EPR titraciju kako bismo procijenili afinitet vezanja αS na različite polikatione u odsutnosti LLPS-a (bez nakupljanja pufer LLPS), što sugerira da su interakcije iste u razrijeđenoj i koncentriranoj fazi (što potvrđuju naši podaci, dopunska slika 4a i dopunska slika 6).Cilj je bio vidjeti pokazuju li svi koacervati, usprkos svojim zajedničkim svojstvima sličnim tekućini, bilo kakvo drugačije ponašanje na molekularnoj razini.Kao što se i očekivalo, EPR spektar se proširio s povećanjem koncentracije polikationa, odražavajući smanjenje molekularne fleksibilnosti zbog molekularnih interakcija svih partnera u interakciji gotovo do zasićenja (slika 3e, dopunska slika 6).pLK je postigao ovo zasićenje pri nižem molarnom omjeru (polikation:αS) u usporedbi s ΔNt-Tau i Tau441.Zapravo, usporedba podataka s približnim modelom vezanja uz pretpostavku n identičnih i neovisnih veznih mjesta pokazala je da je prividna konstanta disocijacije pLK (~5 μM) red veličine niža od one za Tau441 ili ΔNt-Tau (~50 μM ).µM).Iako je ovo gruba procjena, to sugerira da αS ima veći afinitet za jednostavnije polikatione s kontinuiranim područjima pozitivnog naboja.S obzirom na ovu razliku u afinitetu između αS i raznih polikationa, pretpostavili smo da se njihova tekuća svojstva mogu različito mijenjati tijekom vremena i stoga patiti od različitih LSPT procesa.
S obzirom na vrlo napučenu okolinu unutar proteinskog koacervata i amiloidnu prirodu proteina, promatrali smo ponašanje koacervata tijekom vremena kako bismo otkrili moguće LSPT procese.Koristeći BF i CF mikroskopiju (Slika 4), uočili smo da αS/Tau441 koacervira u velikoj mjeri u otopini, tvoreći velike kapljice koje dolaze u kontakt i vlaže površinu na dnu jažice/stakalca kao pune kapljice, kao što se i očekivalo (Dodatna slika 7d);te strukture formirane na dnu nazivamo "proteinskim splavima".Te su strukture ostale fluidne budući da su zadržale sposobnost spajanja (dopunska slika 7b) i mogle su se vidjeti nekoliko sati nakon što je LLPS pokrenut (slika 4 i dopunska slika 7c).Primijetili smo da se proces vlaženja preferira na površini hidrofilnih, a ne hidrofobnih materijala (dodatna slika 7a), kao što se očekuje za elektrostatske koacervate s neuravnoteženim nabojima i stoga visokim elektrostatskim površinskim potencijalima.Naime, koalescencija i rafting αS/ΔNt-Tau značajno su smanjeni, dok su kondenzati αS/pLK značajno smanjeni (Slika 4).Tijekom kratkog vremena inkubacije, kapljice αS/pLK uspjele su se spojiti i smočiti hidrofilnu površinu, no taj se proces brzo zaustavio i nakon 5 sati inkubacije primijećeni su samo ograničeni događaji koalescencije i nikakvo vlaženje.– prijelaz gel-kapanje.
Reprezentativni BF (ploče u sivim tonovima) i CF (desne ploče, AF488 označen αS u zelenoj boji) uzoraka koacervata koji sadrže 100 µM αS (1% fluorescentne oznake) u LLPS puferu u prisutnosti 100 µM Tau441 (gore) fluorescencije) mikroskopske slike ΔNt -Tau (središte) ili 1 mM pLK (dno) u različitim vremenima inkubacije i žarišnim visinama (z, udaljenost od dna jažice ploče).Pokusi su ponovljeni 4-6 puta neovisno jedan o drugom s istim rezultatima.Koacervati αS/Tau441 smoče se nakon 24 sata, tvoreći splavi veće od slike.Mjerna traka za sve slike je 20 µm.
Zatim smo pitali hoće li veliki proteinski bazeni nalik tekućini formirani u αS/Tau441 LLPS dovesti do amiloidne agregacije bilo kojeg proučavanog proteina.Pratili smo sazrijevanje kapljica αS/Tau441 tijekom vremena s WF mikroskopijom pod istim uvjetima kao gore, ali koristeći 1 μM αS obilježenog AF488 i Tau441 obilježenog Atto647N (Sl. 5a).Kao što je i očekivano, promatrali smo potpunu lokalizaciju proteina tijekom procesa sazrijevanja.Zanimljivo, od ca.Nakon 5 sati, uočene su intenzivnije ne-kružne strukture unutar splavi, koje smo nazvali "točkama", od kojih su neke bile kolokalizirane s αS, a neke su bile obogaćene Tau441 (Sl. 5a, bijele strelice).Ove mrlje su uvijek opažene unutar splavi u većoj mjeri za αS/ΔNt-Tau nego za αS/ΔNt-Tau.Nije bilo jasnih mrlja u kapljicama pLK i Tau sustava nesposobnih za fuziju/kvašenje.Kako bismo testirali jesu li ove mrlje koje sadrže αS i Tau441 agregati slični amiloidu, izveli smo sličan eksperiment koristeći CF mikroskopiju u kojoj je Tau441 obilježen s Atto647N i 12,5 μM tioflavina-T (ThT) specifičnog za amiloid dodano je od početka.boja.Iako ThT-bojenje αS/Tau441 kapljica ili splavi nije uočeno ni nakon 24 sata inkubacije (Slika 5b, gornji red—preostale kapljice preko proteinskih splavi), ThT-pozitivne strukture koje sadrže Atto647N-Tau441 unutar splavi bile su vrlo slabe.ovo replicira veličinu, oblik i položaj prethodno opisanih mrlja (Sl. 5b, srednji i donji redovi), sugerirajući da mrlje mogu odgovarati agregatima nalik amiloidu formiranim u tekućim koacervatima starenja.
WF 25 μM αS pri različitim vremenima inkubacije i žarišnim visinama (z, udaljenost od nevezanog dna) u prisutnosti 25 μM Tau441 (1 μM AF488-označenog αS i Atto647N-označenog Tau441) u jažici mikroskopske ploče s LLPS puferom) .Šest eksperimenata je neovisno ponovljeno sa sličnim rezultatima.b CF mikroskopska slika 25 μM αS u prisutnosti 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-označenog Tau441) i 12,5 μM tioflavina-T (ThT).Ponderirane kapljice proteina i taložene proteinske splavi i mrlje prikazani su u gornjem odnosno srednjem redu.Donji red prikazuje slike splavi i spustova iz 3 neovisne kopije.Bijele strelice označavaju ThT-pozitivne točke na obje ploče.Mjerna traka za sve slike je 20 µm.
Kako bismo detaljnije ispitali promjene u proteinskoj mreži koacervata tijekom prijelaza iz tekućeg u kruto stanje, upotrijebili smo fluorescentnu doživotnu sliku (FLIM) i Försterovu rezonantnu mikroskopiju prijenosa energije (FRET) (Slika 6 i dodatne slike 8 i 9).Pretpostavili smo da koacervatno sazrijevanje sloja u više kondenziranu ili čak čvrstu strukturu agregiranog proteina dovodi do bližeg kontakta između proteina i fluorescentne sonde pričvršćene na njega, potencijalno proizvodeći učinak gašenja koji se očituje u skraćenom vijeku trajanja sonde (τ) , kao što je prethodno opisano40.,41 ,42.Osim toga, za dvostruko obilježene uzorke (AF488 i Atto647N kao FRET donorska i akceptorska bojila), ovo smanjenje τ također može biti popraćeno kondenzacijom koacervata i povećanjem učinkovitosti FRET(E) tijekom LSPT.Pratili smo stvaranje splavi i mrlja tijekom vremena u uzorcima LLPS αS/Tau441 i αS/ΔNt-Tau (25 µM svakog proteina u LLPS puferu koji sadrži 1 µM AF488 označenog αS i/ili Atto647N označenog Tau441 ili ΔNt-Tau).Uočili smo opći trend da se životni vijek fluorescencije sondi AF488 (τ488) i Atto647N (τ647N) neznatno smanjio kako su koacervati sazrijevali (Slika 6 i Dodatna slika 8c).Zanimljivo je da je ova promjena značajno pojačana za točkice unutar splavi (Slika 6c), što ukazuje da je došlo do daljnje kondenzacije proteina na točkama.U prilog tome, nije primijećena značajna promjena u životnom vijeku fluorescencije za αS/ΔNt-Tau kapljice stare 24 sata (dodatna slika 8d), što sugerira da je geliranje kapljica proces koji se razlikuje od mrljanja i da nije popraćen značajnom molekularnom reorganizacijom unutar koacervata.Treba napomenuti da točkice imaju različite veličine i promjenjivi sadržaj u αS, posebno za sustav αS/Tau441 (dodatna slika 8e).Smanjenje životnog vijeka fluorescencije točke bilo je popraćeno povećanjem intenziteta, posebno za Atto647N označen Tau441 (dodatna slika 8a), i većom učinkovitošću FRET za oba sustava αS/Tau441 i αS/ΔNt-Tau, što ukazuje na daljnju kondenzaciju u LLPS Pet sati nakon okidanja, proteini unutar statičkog elektriciteta su se kondenzirali.U usporedbi s αS/ΔNt-Tau, primijetili smo niže τ647N i nešto više τ488 vrijednosti u αS/Tau441 točkama, popraćene nižim i nehomogenijim FRET vrijednostima.Moguće je da to može biti povezano s činjenicom da je u sustavu αS/Tau441 promatrana i očekivana zastupljenost αS u agregatima heterogenija, često substehiometrijska u usporedbi s Tau, budući da sam Tau441 također može biti podvrgnut LLPS-u i agregaciji (dodatna slika 8e) .Međutim, stupanj koalescencije kapljica, formiranje splavi i, što je još važnije, agregacija proteina unutar koacervata sličnih tekućini je maksimalan kada su prisutni i Tau441 i αS.
slike cjeloživotne fluorescentne mikroskopije (FLIM) αS/Tau441 i αS/ΔNt-Tau pri 25 μM svakog proteina (1 μM AF488-označenog αS i 1 μM Atto647N-označenog Tau441 ili ΔNt-Tau) u LLPS puferu.Stupci prikazuju reprezentativne slike LLPS uzoraka u različitim vremenima sazrijevanja (30 min, 5 h i 24 h).Crveni okvir prikazuje područje koje sadrži αS/Tau441 mrlje.Životni vijek je prikazan kao trake u boji.Mjerna traka = 20 µm za sve slike.b Uvećana FLIM slika odabranog područja, prikazana u crvenom okviru na ploči a.Rasponi života prikazani su korištenjem iste skale boja kao na ploči a.Mjerna traka = 5 µm.c Histogrami koji prikazuju AF488 (pripojen na αS) ili Atto647N (pripojen na Tau) za različite proteinske vrste (kapljice-D-, splav-R- i speckle-P) identificirane u FLIM slikama snimljenim za αS-) vremenske distribucije životni vijek Tau441 i Uzorci koacervata αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI za D, 29-44 ROI za R i 21-51 ROI za točke).Srednje i srednje vrijednosti prikazane su kao žuti kvadrati i crne linije unutar okvira.Donja i gornja granica okvira predstavljaju prvi odnosno treći kvartil, a minimalne i maksimalne vrijednosti unutar 1,5 puta većeg interkvartilnog raspona (IQR) prikazane su kao brkovi.Outlieri su prikazani kao crni dijamanti.Statistička značajnost između parova distribucija određena je t-testom s dva uzorka, uz pretpostavku nejednakih varijacija.P-vrijednosti dvostranog t-testa prikazane su zvjezdicama za svaki par uspoređivanih podataka (* p-vrijednost > 0,01, ** p-vrijednost > 0,001, *** p-vrijednost > 0,0001, **** p-vrijednost > 0,00001), ns Označava zanemarivost (p-vrijednost > 0,05).Točne p vrijednosti dane su u Dodatnoj tablici 1, a izvorni podaci prikazani su kao neobrađene podatkovne datoteke.
Kako bismo dodatno pokazali amiloidnu prirodu pjega/agregata, tretirali smo neobojene uzorke koacervata 24 sata s visokim koncentracijama (1 M) NaCl, što je rezultiralo odvajanjem agregata od proteinskih koacervata.Kada su izolirani agregati (tj. raspršena otopina agregata) promatrani mikroskopom atomske sile (AFM), uočili smo pretežno sferičnu morfologiju pravilne visine od oko 15 nm, koja ima tendenciju povezivanja u uvjetima visoke koncentracije soli, slično ponašanje tipičnih amiloidnih fibrila zbog snažnog hidrofobnog učinka na površini (imajte na umu da fibrili obično imaju visinu od ~10 nm) (dodatna slika 10a).Zanimljivo, kada su izolirani agregati inkubirani s ThT u standardnom testu fluorescencije ThT, primijetili smo dramatičan porast kvantnog prinosa fluorescencije ThT, usporediv s onim opaženim kada je boja inkubirana s tipičnim αS amiloidnim fibrilima (dodatna slika 10b), što sugerira da koacervatni agregati sadrže strukture slične amiloidu..Zapravo, agregati su bili tolerantni na visoke koncentracije soli, ali osjetljivi na 4 M gvanidin klorida (GdnHCl), poput tipičnih amiloidnih fibrila (dodatna slika 10c).
Zatim smo analizirali sastav agregata korištenjem fluorescencije jedne molekule, korelacijske/unakrsne korelacijske spektroskopije specifične fluorescencije (FCS/FCCS) i burst analize detekcije dvobojnih koincidencija (TCCD).U tu smo svrhu izolirali agregate nastale nakon 24 sata inkubacije u uzorcima od 100 μl LLPS koji sadrže αS i Tau441 (oba 25 μM) zajedno s 1 μM αS obilježenog AF488 i 1 μM Tau441 obilježenog Atto647N.Razrijedite dobivenu otopinu dispergiranog agregata do monomolekularnog stanja koristeći isti pufer bez PEG-a i 1 M NaCl (isti pufer koji se koristi za odvajanje agregata od koacervata) kako biste spriječili sve moguće elektrostatske interakcije između LLPS-a i proteina.Primjer vremenske putanje jedne molekule može se vidjeti na slici 7a.FCCS/FCS analiza (unakrsna korelacija, CC i autokorelacija, AC) pokazala je da su agregati koji sadrže αS i tau bili u izobilju u uzorcima (vidi CC krivulju na slici 7b, lijevi panel), a višak zaostalog monomernog proteina nastao je kao rezultat postupka razrjeđivanja (vidi AC krivulje na slici 7b, lijevi panel).Kontrolni eksperimenti izvedeni pod istim uvjetima otopine koristeći uzorke koji sadrže samo monomerne proteine ​​nisu pokazali CC krivulje, a AC krivulje se dobro uklapaju s jednokomponentnim difuzijskim modelom (Eq. 4), gdje monomerni proteini imaju očekivane koeficijente difuzije (Slika 7b). ), desna ploča).Koeficijent difuzije agregiranih čestica manji je od 1 µm2/s, a monomernih proteina oko 1 µm2/s.50–100 µm/s;vrijednosti su slične prethodno objavljenim vrijednostima za sonicirane αS amiloidne fibrile i monomerni αS odvojeno pod sličnim uvjetima otopine44.Kada smo analizirali agregate TCCD analizom eksplozije (slika 7c, gornja ploča), otkrili smo da je u svakom izoliranom agregatu (αS/Tau heteroagregat), oko 60% otkrivenih agregata sadržavalo i αS i tau, oko 30% sadržavalo je samo tau, samo oko 10% αS.Stehiometrijska analiza αS/Tau heteroagregata pokazala je da je većina heteroagregata obogaćena tau (stehiometrija ispod 0,5, prosječan broj tau molekula po agregatu je 4 puta veći od αS molekula), što je u skladu s našim radom promatranim u FLIM in situ eksperimenti..FRET analiza je pokazala da su ti agregati sadržavali oba proteina, iako stvarne FRET vrijednosti u ovom slučaju nisu od velike važnosti, jer je distribucija fluorofora u svakom agregatu bila nasumična zbog viška neobilježenog proteina korištenog u eksperimentu.Zanimljivo, kada smo izvršili istu analizu korištenjem 45,46 zrele varijante Tau s manjkom agregacije amiloida (vidi dopunsku sliku 11a,b), primijetili smo da iako je αS elektrostatska agregacija bila ista (dopunska slika 11c, d), sposobnost stvaranja agregata unutar koacervata bila je drastično smanjena i FLIM je otkrio nekoliko točaka u in situ eksperimentima, a uočene su slabe krivulje unakrsne korelacije za izolirane uzorke agregata.Međutim, za mali broj otkrivenih agregata (samo jedna desetina Tau441), primijetili smo da je svaki agregat bio obogaćen αS nego ova Tau varijanta, s otprilike 50% otkrivenih agregata koji sadrže samo αS molekule, a αS je bio heterogen u višku .agregata (vidi dopunsku sliku 11e), za razliku od heterogenih agregata koje stvara Tau441 (slika 6f).Rezultati ovih eksperimenata pokazali su da iako se sam αS može akumulirati s tau unutar koacervata, tau nukleacija je povoljnija pod ovim uvjetima, a rezultirajući amiloidni agregati mogu djelovati kao oblik αS i tau.Međutim, jednom kada se formira jezgra bogata tauom, heterotipske interakcije između αS i tau imaju prednost u agregatima u odnosu na homotipske interakcije između tau molekula;također promatramo proteinske mreže u tekućim αS/tau koacervatima.
a Reprezentativni vremenski tragovi fluorescencije pojedinačnih molekula izoliranih agregata formiranih u elektrostatskim koacervatima αS/Tau441.Praskovi koji odgovaraju koagregatima αS/Tau441 (prasovi iznad naznačenog praga) primijećeni su u tri detekcijska kanala (emisija AF488 i Atto647N nakon izravne pobude, plave i crvene linije, emisija Atto647N nakon neizravne pobude), FRET, ljubičasta linija).b FCS/FCCS analiza uzorka izoliranih αS/Tau441 agregata dobivenih od LLPS (lijeva ploča).Krivulje autokorelacije (AC) za AF488 i Atto647N prikazane su plavom i crvenom bojom, a krivulje unakrsne korelacije (CC) povezane s agregatima koji sadrže obje boje prikazane su ljubičastom bojom.AC krivulje odražavaju prisutnost obilježenih monomernih i agregiranih proteinskih vrsta, dok CC krivulje pokazuju samo difuziju dvostruko obilježenih agregata.Ista analiza, ali pod istim uvjetima otopine kao u izoliranim točkama, uzorci koji sadrže samo monomerni αS i Tau441 prikazani su kao kontrole na desnoj ploči.c Analiza bljeskalice fluorescencije pojedinačnih molekula izoliranih agregata formiranih u elektrostatskim koacervatima αS/Tau441.Informacije za svaki agregat pronađen u četiri različita ponavljanja (N = 152) ucrtavaju se u odnosu na njihovu stehiometriju, S vrijednosti i FRET učinkovitost (gornja ploča, traka u boji odražava pojavu).Mogu se razlikovati tri vrste agregata: -αS-samo agregati sa S~1 i FRET~0, Tau-samo agregati sa S~0 i FRET~1, i heterogeni Tau/αS agregati sa intermedijarnim S i FRET Procjene količine oba proteina markera detektirana u svakom heterogenom agregatu (N = 100) prikazani su na donjoj ploči (ljestvica boja odražava pojavu).Neobrađeni podaci daju se u obliku datoteka neobrađenih podataka.
Zabilježeno je da je sazrijevanje ili starenje kondenzata tekućih proteina u gelaste ili čvrste strukture tijekom vremena uključeno u nekoliko fizioloških funkcija kondenzata47 kao i u bolesti, kao abnormalni proces koji prethodi agregaciji amiloida 7, 48, 49. Ovdje detaljno proučavamo razdvajanje faza i ponašanje.LSPT αS u prisutnosti nasumičnih polikationa u kontroliranom okruženju pri niskim mikromolarnim koncentracijama i fiziološki relevantnim uvjetima (imajte na umu da je izračunata fiziološka koncentracija αS >1 µM50), slijedeći tipično termodinamički vođeno ponašanje LPS-a.Otkrili smo da αS, koji sadrži visoko negativno nabijenu C-terminalnu regiju pri fiziološkom pH, može formirati kapljice bogate proteinima u vodenoj otopini putem LLPS-a u prisutnosti visoko kationskih poremećenih peptida kao što su pLK ili Tau kroz proces elektrostatike kompleksna kondenzacija u prisutnosti agregacijskih makromolekula.Ovaj proces može imati relevantne učinke u staničnom okruženju gdje αS nailazi na različite polikationske molekule povezane s njegovom agregacijom povezanom s bolešću, kako in vitro tako i in vivo 51,52,53,54.
U mnogim studijama, dinamika proteina unutar kapljica smatrana je jednim od ključnih čimbenika koji određuju proces sazrijevanja55,56.U elektrostatskim αS koacervatima s polikationima proces sazrijevanja očito ovisi o snazi ​​interakcija s polikationima, valenciji i višestrukosti tih interakcija.Teorija ravnoteže sugerira da bi ravnotežni krajolik dva tekuća stanja bio prisutnost velike kapljice bogate biopolimerima koji pokreću LLPS57,58.Rast kapljica može se postići Ostwaldovim sazrijevanjem59, koalescencijom60 ili potrošnjom slobodnog monomera u disperziranoj fazi61.Za αS i Tau441, ΔNt-Tau ili pLK, većina proteina bila je koncentrirana u kondenzatu pod uvjetima korištenim u ovoj studiji.Međutim, dok su se tau kapljice pune veličine brzo spajale nakon vlaženja površine, spajanje i vlaženje kapljica bilo je teško za ΔNt-Tau i pLK, što ukazuje na brz gubitak svojstava tekućine u ova dva sustava.Prema našoj FLIM-FRET analizi, ostarjele kapljice pLK i ΔNt-Tau pokazale su sličan stupanj agregacije proteina (sličan životni vijek fluorescencije) kao izvorne kapljice, što sugerira da je originalna proteinska mreža zadržana, iako čvršća.
Racionaliziramo naše eksperimentalne rezultate u sljedećem modelu (Slika 8).Prvobitno privremeno formirane kapljice često su proteinske mreže bez elektrostatske kompenzacije, pa stoga postoje područja neravnoteže naboja, posebno na sučelju kapljica, što rezultira kapljicama s visokim elektrostatskim površinskim potencijalom.Kako bi se kompenzirao naboj (fenomen koji se obično naziva deplecija valencije) i minimizirao površinski potencijal kapljica, kapljice mogu uključivati ​​nove polipeptide iz razrijeđene faze, reorganizirati proteinske mreže kako bi se optimizirale interakcije naboja i naboja i djelovati s drugim kapljicama.s površinama (kvašenje).Kapljice αS/pLK, zbog svoje jednostavnije proteinske mreže (samo heterotipske interakcije između αS i pLK) i većeg afiniteta za interakcije protein-protein, čini se da mogu brže uravnotežiti naboj kondenzata;doista, primijetili smo bržu kinetiku proteina u početno formiranim αS/pLK koacervatima nego u αS/Tau.Nakon smanjenja valencije, interakcije postaju manje efemerne i kapljice gube svoja tekuća svojstva i pretvaraju se u gelaste, nezapaljive kapljice s niskim elektrostatskim površinskim potencijalom (i stoga ne mogu smočiti površinu).Nasuprot tome, αS/Tau kapljice manje su učinkovite u optimiziranju ravnoteže naboja kapljica zbog složenijih proteinskih mreža (s homotipskim i heterotipskim interakcijama) i slabije prirode proteinskih interakcija.To rezultira kapljicama koje zadržavaju tekuće ponašanje tijekom duljeg vremenskog razdoblja i pokazuju visok elektrostatski površinski potencijal koji se nastoji minimizirati spajanjem i rastom (time minimizirajući omjer površine/volumena kapljica) i vlaženjem hidrofilne površinske kemije.Ovo stvara velike koncentrirane knjižnice proteina koje zadržavaju svojstva tekućine jer interakcije ostaju vrlo prolazne zbog stalne potrage za optimizacijom naboja u proteinskoj mreži.Zanimljivo je da N-terminalno skraćeni oblici Tau, uključujući neke prirodne izoforme62, pokazuju srednje ponašanje, pri čemu neki koacervati stare s αS u dugovječne gelaste kapljice, dok se drugi pretvaraju u velike tekuće kondenzate.Ova dualnost u sazrijevanju αS elektrostatskih koacervata u skladu je s nedavnim teorijskim i eksperimentalnim studijama LLPS-a koje su identificirale korelaciju između smanjenja valencije i elektrostatskog prosijavanja u kondenzatima kao ključ za kontrolu veličine kondenzata i svojstava tekućine.Mehanizam 58.61.
Ova shema prikazuje navodni put agregacije amiloida za αS i Tau441 putem LLPS i LSPT.S dodatnim područjima bogatim anionima (crveno) i kationima (plavo), elektrostatski koacervati αS i tau sa zadovoljavajućom valencijom imaju nižu površinsku energiju i stoga manje spajanje, što rezultira brzim starenjem kapljica.Postiže se stabilno neaglomerirano stanje gela..Ova situacija je vrlo povoljna u slučaju αS/pLK sustava zbog njegovog većeg afiniteta i jednostavnije mreže interakcija proteinskih parova, što omogućuje brz prijelaz nalik gelu.Naprotiv, kapljice s nezadovoljavajućom valencijom i, stoga, regijama nabijenim proteinima dostupnim za interakciju, olakšavaju koacervatu spajanje i vlaženje hidrofilne površine kako bi se smanjila njegova visoka površinska energija.Ova situacija je poželjnija za αS/Tau441 koacervate, koji imaju multivalentnu kompleksnu mrežu koja se sastoji od slabih interakcija Tau-Tau i αS-Tau.S druge strane, veći koacervati će lakše zadržati svoja svojstva slična tekućini, dopuštajući druge interakcije protein-protein.Na kraju se unutar koacervatne tekućine formiraju amiloidni heterogeni agregati koji sadrže i αS i tau, što može biti povezano s onima koji se nalaze u inkluzijskim tjelešcima, a koja su obilježja neurodegenerativnih bolesti.
Velike strukture nalik tekućini nastale tijekom sazrijevanja αS/Tau441 s visoko zagušenim, ali dinamičnim proteinskim okruženjem i, u manjoj mjeri, αS/ΔNt-Tau koacervatima idealni su rezervoari za nukleaciju agregacije proteina.Doista smo primijetili stvaranje čvrstih proteinskih agregata u ovoj vrsti proteinskih koacervata, koji često sadrže i αS i tau.Pokazali smo da su ovi heteroagregati stabilizirani neelektrostatskim interakcijama, da su sposobni vezati amiloidne specifične ThT boje na isti način kao tipične amiloidne fibrile, i doista imaju sličnu otpornost na različite utjecaje.Pokazalo se da αS/tau agregati koje stvara LLPS imaju svojstva slična amiloidu.Doista, zrela varijanta Tau s nedostatkom agregacije amiloida značajno je oštećena u formiranju ovih heterogenih αS agregata unutar tekućeg elektrostatskog koacervata.Formiranje αS/Tau441 agregata uočeno je samo unutar koacervata, koji su zadržali svojstva slična tekućini, i nikada, ako koacervati/kapljice nisu dosegli stanje gela.U potonjem slučaju, povećana snaga elektrostatskih interakcija i, kao rezultat toga, krutost proteinske mreže sprječavaju nužne konformacijske preuredbe proteina za uspostavljanje novih proteinskih interakcija potrebnih za nukleaciju amiloida.Međutim, to se može postići u fleksibilnijim koacervatima nalik tekućini, za koje je vjerojatnije da će ostati tekući dok se povećavaju.
Činjenica da je stvaranje agregata unutar kondenzirane faze poželjnije u velikim αS/Tau kondenzatima nego u malim kapljicama koje brzo geliraju, naglašava važnost identificiranja čimbenika koji kontroliraju koalescenciju kapljica.Dakle, ne samo da postoji tendencija odvajanja faza, već se veličina kondenzata mora kontrolirati radi pravilnog funkcioniranja kao i prevencije bolesti58,61.Naši rezultati također naglašavaju važnost ravnoteže između LLPS i LSPT za αS/Tau sustav.Dok stvaranje kapljica može zaštititi od agregacije amiloida smanjenjem količine proteinskih monomera dostupnih u uvjetima zasićenja, kao što je predloženo u drugim sustavima63,64, spajanje kapljica na visokim razinama kapljica može dovesti do unutarnje agregacije proteina putem sporih konformacijskih preuređenja.proteinske mreže..
Sveukupno, naši podaci snažno naglašavaju važnost kohezivne valencije i zadovoljnih/nezadovoljnih interakcija u mrežama pada u kontekstu LSPT-a.Konkretno, pokazujemo da se kondenzati αS/Tau441 pune duljine mogu učinkovito spojiti i nukleirati kako bi formirali heteroagregate slične amiloidu koji uključuju oba proteina i predlažemo molekularni mehanizam temeljen na našim eksperimentalnim rezultatima.Koagregacija dvaju proteina u koacervatu tekućine αS/Tau o kojoj ovdje izvješćujemo može doista biti povezana s ko-lokalizacijom dvaju proteina u inkluzijama, koje su obilježja bolesti, i može doprinijeti razumijevanju odnosa između LLPS-a i agregacija amiloida, utirući put za visoko nabijeni IDP u neurodegeneraciji.
Monomerni WT-αS, mutanti cisteina (Q24C-αS, N122C-αS) i varijante ΔCt-αS (Δ101-140) eksprimirani su u E. coli i pročišćeni kako je prethodno opisano.5 mM DTT je uključeno u sve korake u pročišćavanju mutanata αS cisteina kako bi se spriječilo stvaranje disulfidne veze.Tau441 izoforma (plazmid dobiven iz Addgene #16316), ΔNt-Tau varijanta (Δ1-150, dobivena kloniranjem IVA s početnicama CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) i AggDef-Tau varijanta (Δ275-311, pročišćena s GGCTC 5 primer) Kulture E. coli bile su narastao je do OD600 = 0,6–0,7 na 37°C i 180 okretaja u minuti, a ekspresija je inducirana s IPTG-om tijekom 3 sata na 37°C.Sakupite stanice pri 11 500 xg tijekom 15 minuta pri 4 °C i isperite slanim puferom koji sadrži 150 mM NaCl.Resuspendirajte talog u puferu za lizu (20 ml po 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidin 50 µM, kopeptin 100 µM).Korak sonikacije izveden je na ledu s amplitudom od 80% za 10 impulsa (1 min uključen, 1 min isključen).Nemojte prekoračiti 60 ml u jednom ultrazvuku.Lizati E. coli zagrijavani su na 95°C 20 minuta, zatim ohlađeni na ledu i centrifugirani na 127,000 x g 40 minuta.Pročišćeni supernatant nanese se na membranu od 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) i dijalizira s 4 L pufera za dijalizu (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0,1 mM) tijekom 10 sati.Kolona za kationsku izmjenu od 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) bila je ekvilibrirana s puferom za ekvilibraciju (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau lizat je filtriran kroz 0,22 μm PVDF filter i ubrizgan u kolonu pri brzini protoka od 1 ml/min.Elucija je provedena postupno, tau je eluiran s 15-30% puferom za eluiranje (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Frakcije su analizirane pomoću SDS-PAGE, a sve frakcije koje sadrže jednu traku s očekivanom molekularnom težinom tau koncentrirane su korištenjem 10 kDa centrifugalnog filtera i zamijenjene puferom koji sadrži 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM i DTT 2 mM za konačna koncentracija proteina bila je 100 μM.Proteinska otopina je zatim propuštena kroz 0,22 μm PVDF filter, brzo zamrznuta i pohranjena na -80°C.Protein K18 je ljubazno ustupio prof. Alberto Boffi.Čistoća pripravka bila je >95% što je potvrđeno pomoću SDS-PAGE i MALDI-TOF/TOF.Razni cisteini kemijski su obilježeni AlexaFluor488-maleimidom (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAD) ili TEMPOL-maleimidom (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).potvrđeni su apsorbancijom i MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau i K18 obilježeni su nativnim cisteinskim ostacima na pozicijama 191 i 322 pomoću Atto647N-maleimida (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Njemačka) prema istom postupku.Karte neto naknade po ostatku za αS i Tau441 generirane su pomoću CIDER66.
Čvrsti poli-L-lizin (pLK DP 90-110 prema NMR od dobavljača, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, SAD) otopljen je u 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, koncentracija pH 7,4 do 10 mM, proces sonikiran 5 minuta u ultrazvučnoj vodenoj kupelji i čuvati na -20°C.PEG-8, dekstran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, SAD) i FITC-dekstran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, SAD) su topljivi u vodi i široko rasprostranjeni u LLPS puferu.Dijalizom se uklanjaju kontaminirajuće soli.Zatim su filtrirani kroz špric filter s veličinom pora od 0,22 μm, a koncentracije su im izračunate pomoću refraktometra (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, SAD).LLPS uzorci pripremljeni su na sobnoj temperaturi sljedećim redoslijedom: pufer i ekstruzija su pomiješani i 1 mM tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(etan- 1,2-diildinitril) tetraoctene kiseline (EDTA, carboxynth) i mješavine 1% inhibitora proteaze (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leupeptin 5 μM).Zatim se dodaju αS i spojeni polikationi (opcije pLK ili Tau).Za eksperimente vremenskih serija tioflavina-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), upotrijebite ukupnu koncentraciju ThT koja je pola koncentracije αS.Nježno, ali temeljito promiješajte uzorke kako biste bili sigurni da su homogeni.Koncentracija svake komponente varirala je od eksperimenta do eksperimenta, kao što je opisano u odjeljku Rezultati.Azid je korišten u koncentraciji od 0,02% (w/v) kad god je trajanje eksperimenta prelazilo 4 sata.Za sve analize koje koriste LLPS uzorke, ostavite smjesu da se uravnoteži 5 minuta prije analize.Za analizu raspršenja svjetlosti, 150 µl uzoraka naneseno je na neobvezujuće mikroploče s 96 jažica (µClear®, crna, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austrija) i prekriveno ljepljivim filmom.LLP su praćeni mjerenjem apsorbancije na 350 nm u središtu otopine u čitaču ploča CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Njemačka).Pokusi su izvedeni u tri primjerka na 25°C, a pogreške su izračunate kao standardna devijacija od srednje vrijednosti.Razrijeđena faza je kvantificirana centrifugiranjem uzorka i SDS-PAGE gel analizom, a frakcija αS u razrijeđenoj i koncentriranoj fazi je kvantificirana u različitim LLPS otopinama.Uzorak od 100 μl LLPS koji je sadržavao 1 μM αS obilježenog AF488 pripremljen je temeljitim miješanjem nakon čega je uslijedilo centrifugiranje na 9600 × g tijekom 30 minuta, nakon čega je talog obično bio vidljiv.Gornjih 50 μl supernatanta korišteno je za kvantifikaciju proteina pomoću SDS-PAGE gela.Gelovi su skenirani s AF488 filtrima pomoću ChemiDoc gel imaging sustava (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, SAD) ili su obojeni Coomassie bojom i vizualizirani s odgovarajućim filtrima.Rezultirajuće trake analizirane su pomoću ImageJ verzije 1.53i (Nacionalni instituti za zdravlje, SAD).Eksperimenti su provedeni u duplikatu u dva različita eksperimenta sa sličnim rezultatima.
Obično je 150 μl uzoraka naneseno na mikroploče s 96 jažica koje se ne vežu i vizualizirano na sobnoj temperaturi na invertnom mikroskopu Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Njemačka).Za spot eksperimente također su korištene µ-Slide Angiogenesis ploče (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Njemačka) ili polistirenske mikroploče s 96 jažica (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Kao izvori osvjetljenja korištene su halogene ili živine metalhalogene žarulje EL6000 (za BF/DIC i WF snimanje).Za WF mikroskopiju korišten je zračni objektiv s povećanjem od 40x (Leica Microsystems, Njemačka) za fokusiranje svjetla na uzorak i njegovo prikupljanje.Za uzorke s oznakama AF488 i ThT, filtrirajte ekscitaciju i emisiju sa standardnim GFP filtarskim setovima, ekscitacijski i emisijski propusni filtri, redom, 460–500 nm i 512–542 nm propusni filtri i dikroično zrcalo od 495 nm.Za uzorke označene s Atto647N, korišten je standardni set Cy5 filtara s ekscitacijskim i emisijskim propusnim filtrima 628–40 nm, odnosno 692–40 nm, te dikroičnim zrcalom od 660 nm.Za BF i DIC mikroskopiju koristite isti objektiv za sakupljanje reflektirane svjetlosti.Prikupljena svjetlost je snimljena na Leica DFC7000 CCD kameri (Leica Microsystems, Njemačka).Vrijeme ekspozicije bilo je 50 ms za BF i DIC mikroskopsko snimanje i 20-100 ms za WF mikroskopsko snimanje.Za usporedbu, vrijeme ekspozicije za sve eksperimente s THT bilo je 100 ms.Provedeni su eksperimenti s vremenskim odmakom kako bi se vizualiziralo spajanje kapljica, pri čemu su slike prikupljane svakih 100 ms nekoliko minuta.Za analizu slike korišten je ImageJ (NIH, SAD).Pokusi su provedeni u tri primjerka sa sličnim rezultatima.
Za eksperimente kolokalizacije, FRAP i 3D rekonstrukciju, slike su dobivene na Zeiss LSM 880 invertiranom konfokalnom mikroskopu korištenjem ZEN 2 plavog izdanja (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Njemačka).Uzorci od 50 µl naneseni su na µ-Slide Angiogenesis Petrijeve zdjelice (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Njemačka), tretirani hidrofilnim polimerom (ibiTreat) i montirani u 63× uljni imerzijski objektiv (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) na DIC-u).Slike su dobivene korištenjem linija argonskog lasera od 458 nm, 488 nm i 633 nm s rezolucijom od 0,26 µm/pikselu i vremenom ekspozicije od 8 µs/pikselu za prozore detekcije ekscitacije i emisije od 470-600 nm, 493-628 nm, i 638–755 nm korišteno je za vizualizaciju ThT, AF488 odnosno Atto647N.Za FRAP pokuse, fotografija svakog uzorka snimljena je brzinom od 1 slike u sekundi.Pokusi su provedeni u tri primjerka na sobnoj temperaturi sa sličnim rezultatima.Sve su slike analizirane pomoću softvera Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Njemačka).FRAP krivulje su normalizirane, iscrtane i prilagođene podacima o intenzitetu/vremenu izdvojenim iz slika pomoću Zen 2 pomoću OriginPro 9.1.Krivulje oporavka prilagođene su monoeksponencijalnom modelu kako bi se uzela u obzir molekularna difuzija s dodatnim eksponencijalnim članom koji bi objasnio učinak akvizicijskog izbjeljivanja.Zatim smo izračunali D korištenjem nominalnog radijusa izbjeljivanja i prethodno određenog poluživota oporavka kao u jednadžbi Kang et al.5 35 prikazano.
Pojedinačne cisteinske varijante αS sintetizirane su s 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksilom (TEMPOL) na pozicijama 24 (TEMPOL-24-αS) i 122 (TEMPOL-122-αS), odnosno.Označavanje spinom Za EPR pokuse, koncentracija αS postavljena je na 100 μM, a koncentracija PEG bila je 15% (w/v).Za različite uvjete agregacije, omjer αS:pLK bio je 1:10, dok su omjeri αS:ΔNt-Tau i αS:Tau441 održavani na 1:1.Za pokuse titracije vezanja u odsutnosti gužve, TEMPOL-122-αS je održavan na 50 μM, a polikationi su titrirani pri rastućim koncentracijama, pripremajući svaki uvjet zasebno.CW-EPR mjerenja provedena su pomoću Bruker ELEXSYS E580 X-pojasnog spektrometra opremljenog Bruker ER4118 SPT-N1 rezonatorom koji radi na mikrovalnoj (SHF) frekvenciji od ~9,7 GHz.Temperatura je postavljena na 25°C i kontrolirana kriostatom s tekućim dušikom.Spektri su dobiveni u nezasićenim uvjetima pri MW snazi ​​od 4 mW, amplitudi modulacije od 0,1 mT i frekvenciji modulacije od 100 kHz.Spektralni intenziteti su normalizirani kako bi se izbjegle razlike u koncentracijama spina između uzoraka i moguće smanjenje spina zbog rezidualnih koncentracija redukcijskih sredstava u uzorcima koji sadrže Tau441 ili ΔNt-Tau (prisutan u izvornim otopinama proteina).Zadane vrijednosti g dobivene su kao rezultat EPR spektralnog modeliranja provedenog pomoću softvera Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) implementiranog u Matlab®67.Za modeliranje podataka korišteni su jedno/dvokomponentni izotropni modeli.Nakon normalizacije svih signala, reziduali su izračunati oduzimanjem svake simulacije od odgovarajućeg eksperimentalnog spektra.Za analizu titracije vezanja, relativni intenzitet treće vrpce u odnosu na drugu vrpcu normaliziranog EPR spektra (III/III) korišten je za praćenje vezanja polikationa na αS.Za procjenu konstante disocijacije (Kd), rezultirajuća krivulja je prilagođena približnom modelu uz pretpostavku n identičnih i neovisnih veznih mjesta.
Eksperimenti NMR spektroskopije provedeni su pomoću Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spektrometra opremljenog kriosondom i Z-gradijentom.Svi eksperimenti su izvedeni korištenjem 130-207 µM αS i odgovarajućih αS/ΔNt-Tau i pLK ekvivalenata u 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 i izvedeni su na 15°C.Za praćenje LPS-a pomoću NMR-a, 10% PEG je dodano prethodno pomiješanim uzorcima.Grafik perturbacije kemijskog pomaka (slika 1b) prikazuje prosječne 1H i 15N kemijske pomake.Spektri αS 2D1H-15N HSQC dodijeljeni su na temelju prethodne dodjele (BMRB unos #25227) i potvrđeni snimanjem i analizom 3D spektara HNCA, HNCO i CBCAcoNH.Kemijski pomaci 13Cα i 13Cβ izračunati su u prisutnosti ΔNt-Tau ili pLK kako bi se izmjerile moguće promjene u trendovima sekundarne strukture u usporedbi s kemijskim pomacima αS u čistoj slučajnoj konformaciji zavojnice 68 (dodatna slika 5c).Brzine R1ρ mjerene su snimanjem eksperimenata hsqctretf3gpsi (dobivenih iz Brukerove biblioteke) s kašnjenjima od 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 i 800 ms, a eksponencijalne funkcije prilagođene su kašnjenjima vršnog intenziteta na različitim puta za određivanje R1ρ i njegove eksperimentalne nesigurnosti.
Eksperimenti dvobojne vremenski razlučne fluorescentne mikroskopije izvedeni su na komercijalnom vremenski razlučnom fluorescentnom konfokalnom mikroskopu MT200 (PicoQuant, Berlin, Njemačka) s vremenski koreliranim uređajem za brojanje jednog fotona (TCSPC).Glava laserske diode koristi se za pulsirajuću isprepletenu pobudu (PIE), zraka prolazi kroz jednomodni valovod i podešena je na snagu lasera od 10 do 100 nW za laserske linije od 481 nm i 637 nm mjerene nakon dikroičnog zrcala.To osigurava optimalnu brzinu brojanja fotona, izbjegavajući efekte fotonskog alijasa, fotoizbjeljivanja i zasićenja.Pokrovnice ili ploče za angiogenezu μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Njemačka) postavljene su izravno u vodu za uranjanje preko leće Super Apochromat 60x NA 1.2 s korektivnim ovratnikom (Olympus Life Sciences, Waltham, SAD).Dikroično zrcalo od 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, SAD) korišteno je kao razdjelnik glavnog snopa.Nefokusirano zračenje blokira se rupom promjera 50 mikrona, a zatim se fokusirano zračenje dijeli na 2 staze detekcije pomoću razdjelnika snopa 50/50.Ispred detektora korišteni su propusni filteri (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 za zelenu boju (AF488) i 690/70 za crvenu boju (Atto647N).Kao detektori korištene su jednofotonske lavinske diode (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italija).I prikupljanje i analiza podataka provedeni su korištenjem komercijalno dostupnog softvera SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Berlin, Njemačka).
Pedeset mikrolitara LLPS uzoraka naneseno je na jažice za angiogenezu μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Njemačka).Rezultirajuće slike fokusirane su na 20 µm iznad dna bunara za optimalnu radnu udaljenost objektiva za lebdeće kapljice i na ~1 µm za splavi i točkice s aksijalnom rezolucijom od najmanje 0,25 µm/pikselu i vremenom odgode od 400 µs/pikselu.Odaberite podatke primjenom praga intenziteta na temelju prosječnog intenziteta pozadinskog signala (PBG, srednja vrijednost + 2σ) za svaki kanal tako da se odaberu samo kapljice tekućeg proteina, splavi ili mrlje, filtrirajući svako moguće podrijetlo iz disperzne faze.Kako bismo analizirali životni vijek svake vrste (τ) svakog kanala (zeleno, "g" za AF488 i crveno, "r" za Atto647N), odabrali smo područja od interesa (ROI) koja sadrže kapljice, splavi ili mrlje (dodatna slika 1 ).8b) i izvedeni su prilagođavanjem njihovog opadanja tijekom trajanja (τD, τR i τP za kapljice, splavi ili mrlje, vidi dopunsku sliku 8c) u svakom kanalu koristeći analizu repa i dvokomponentni model opadanja.Prosjek τ iz τ .ROI koji su proizveli premalo fotona za multieksponencijalno uklapanje isključeni su iz analize.Korištena granična vrijednost bila je <104 fotona za splavi i točkice i 103 za kapi.Kapljice imaju niži prag jer je teško dobiti krivulje raspada s višim vrijednostima intenziteta, jer su kapljice u polju slike obično manje i manje ih je.ROI s brojem fotona iznad granice nakupljanja fotona (postavljen na >500 brojača po pikselu) također su odbačeni za analizu.Uskladite krivulju opadanja intenziteta dobivenu iz interesnog područja s intenzitetom na 90% maksimuma (malo nakon maksimalnog intenziteta opadanja) od početka životnog vijeka kako biste osigurali minimalne IRF smetnje uz održavanje istog za sve opadanje intenziteta postavke Relativni vremenski prozor Analizirano je 25 do 50 ROI za splavi i točke i 15-25 ROI za padove, slike odabrane iz više od 4 replikata snimljenih iz najmanje 3 neovisna eksperimenta.Dvostrani t-testovi korišteni su za procjenu statističkih razlika između vrsta ili između koacervatnih sustava.Za piksel po piksel analizu životnog vijeka (τ), izračunata je ukupna atenuacija životnog vijeka preko polja za svaki kanal i izvršena je aproksimacija 2/3-komponentnog eksponencijalnog modela atenuacije.Životno prigušenje za svaki piksel zatim je prilagođeno korištenjem prethodno izračunatih τ vrijednosti, što je rezultiralo pseudobojnom FLIM fit slikom.Raspon životnog vijeka repa bio je isti na svim slikama istog kanala, a svaki raspad proizveo je dovoljno fotona da osigura pouzdano uklapanje.Za FRET analizu, pikseli su odabrani primjenom nižeg praga intenziteta od 100 fotona, što je u prosjeku pozadinski signal (FBG) od 11 fotona.Intenzitet fluorescencije svakog kanala korigiran je eksperimentalno određenim faktorima korekcije: 69 spektralni preslušavanje α bio je 0,004, izravna ekscitacija β bila je 0,0305, učinkovitost detekcije γ bila je 0,517.Učinkovitost FRET na razini piksela tada se izračunava pomoću sljedeće jednadžbe:
gdje je FDD intenzitet fluorescencije opažen u donorskom (zelenom) kanalu, FDA je intenzitet fluorescencije opažen u akceptorskom (crvenom) kanalu pod neizravnom ekscitacijom, a FAA je intenzitet fluorescencije opažen u akceptorskom (crvenom) kanalu pod izravnom ekscitacijom ( PITA).U kanalu se opažaju impulsi intenziteta fluorescencije).
Stavite 100 µl LLPS reakcijskih otopina koje sadrže 25 µM neobilježenog monomernog Tau441 (sa ili bez 25 µM αS) u LLPS pufer (dopunjen kao gore) na nevezujuće mikroploče s 96 jažica s ljepljivom folijom, a formiranje kapljica je provjereno WF mikroskopijom nakon ekvilibracija.unutar 10 min.Nakon 48 sati inkubacije na sobnoj temperaturi, potvrđena je prisutnost proteinskih splavi i mrlja.Zatim pažljivo uklonite tekućinu preko splavi iz jažica, zatim dodajte 50 L pufera za disocijaciju (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) i inkubirajte 10 minuta.Visoka koncentracija soli osigurava da se LLPS neće ponoviti zbog zaostalog PEG-a, a mogući sklopovi proteina formirani samo elektrostatskim interakcijama bit će rastavljeni.Dno jažice je zatim pažljivo ostrugano vrhom mikropipete i dobivena otopina je prebačena u praznu jažicu za promatranje.Nakon inkubacije uzoraka s 50 µM ThT tijekom 1 sata, prisutnost izoliranih mrlja provjerena je WF mikroskopijom.Pripremite sonicirane αS fibrile inkubiranjem 300 µl 70-µM otopine αS u PBS-u s pH 7,4, natrijevim azidom 0,01% na 37 °C i 200 okretaja u minuti na orbitalnoj mućkalici tijekom 7 dana.Otopina je zatim centrifugirana na 9600×g 30 minuta, talog je resuspendiran u PBS pH 7,4 i sonikiran (1 minuta, 50% ciklus, 80% amplituda u Vibra-Cell VC130 sonikatoru, Sonics, Newton, SAD) uzoraka fibrila s relativno ujednačenom raspodjelom veličine malih fibrila.
Analiza FCS/FCCS i detekcija dvobojne koincidencije (TCCD) provedeni su na istom MT200 vremenski razlučnom fluorescentnom konfokalnom mikroskopu (Pico-Quant, Berlin, Njemačka) koji se koristio za mikroskopske eksperimente FLIM-FRET koristeći PIE način rada.Snaga lasera za ove eksperimente je dodana na 6,0 µW (481 nm) i 6,2 µW (637 nm).Kombinacija ovih laserskih snaga odabrana je da proizvede sličnu svjetlinu za parove korištenih fluorofora uz postizanje optimalnih brzina brojanja i izbjegavanje fotoizbjeljivanja i zasićenja.I prikupljanje i analiza podataka provedeni su korištenjem komercijalno dostupnog softvera SymphoTime64 verzija 2.3 (PicoQuant, Berlin, Njemačka).
Uzorci izoliranih αS/Tau agregata dobivenih pomoću LLPS-a razrjeđuju se u izolacijskom puferu do odgovarajuće monomolekularne koncentracije (obično razrjeđenje 1:500, budući da su agregati već u niskim koncentracijama kada su izolirani iz uzoraka koacervata).Uzorci su naneseni izravno na pokrovno stakalce (Corning, SAD) prethodno obloženo otopinom BSA u koncentraciji od 1 mg/mL.
Za PIE-smFRET analizu u zelenim i crvenim kanalima, primijenjen je niži prag intenziteta od 25 fotona kako bi se filtrirali signali niskog intenziteta uzrokovani monomernim događajima (imajte na umu da monomeri nadmašuju agregirane uzorke u usporedbi s izoliranim agregatima).Taj je prag izračunat kao peterostruki prosječni intenzitet monomernog αS dobivenog analizom uzoraka čistog monomera kako bi se specifično odabrali agregati za analizu.PIE pogonski krug, zajedno s TSCPC prikupljanjem podataka, omogućio je primjenu doživotnog filtra za težinu koji pomaže eliminirati pozadinu i spektralne preslušavanja.Intenzitet bljeska odabran korištenjem gornjih pragova ispravljen je korištenjem prosječnog pozadinskog signala određenog iz histograma pojavljivanja u odnosu na intenzitet/binu uzoraka samo za pufer.Burstovi povezani s velikim agregatima obično zauzimaju nekoliko uzastopnih spremnika u vremenskom tragu (postavljenom na 1 ms).U tim je slučajevima odabrana posuda maksimalne snage.Za FRET i stehiometrijsku analizu korišten je teorijski određen gama faktor γ (0,517).Doprinosi spektralnog preslušavanja i izravne pobude zanemarivi su (određeni eksperimentalno) pri korištenoj snazi ​​pobudnog lasera.Učinkovitost i stehiometrija FRET-a u eksploziji izračunavaju se kako slijedi.