347 kemijska komponenta namotanih cijevi od nehrđajućeg čelika, Identifikacija novih proteina šaperona humanog leukocitnog antigena-A (HLA-A) koji reagiraju na interferon korištenjem umrežene masene spektrometrije (CLMS)

Hvala što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, web stranicu prikazujemo bez stilova i JavaScripta.
Klizači koji prikazuju tri članka po slajdu.Za pomicanje kroz slajdove koristite gumbe Natrag i Sljedeće ili gumbe za upravljanje slajdovima na kraju za kretanje kroz svaki slajd.

Opis proizvoda

Zavojne cijevi od nehrđajućeg čelika 347L, klasa čelika: SS347L

Interferonski signalni sustav inducira snažan odgovor citokina na širok raspon patogenih i intrinzičnih patoloških signala iz okoline, što rezultira indukcijom podskupa proteina induciranih interferonom.Primijenili smo DSS-posredovanu cross-link masenu spektrometriju (CLMS) kako bismo detektirali nove protein-protein interakcije u domeni proteina induciranih interferonom.Uz očekivane proteine ​​inducibilne interferonom, također smo identificirali nove intermolekularne i intramolekularne umrežene adukte kanonskih proteina inducibilnih interferonom kao što su MX1, USP18, OAS3 i STAT1.Usredotočili smo se na ortogonalnu validaciju novog skupa interferonom inducibilnih proteinskih mreža koje tvore HLA-A proteini (H2BFS-HLA-A-HMGA1) korištenjem koimunoprecipitacije i njihovo daljnje proučavanje korištenjem modeliranja molekularne dinamike.Modeliranje konformacijske dinamike proteinskog kompleksa otkrilo je nekoliko mjesta interakcije koja odražavaju interakcije identificirane u nalazima CLMS-a.Zajedno predstavljamo pilot studiju CLMS-a za identificiranje novih signalnih kompleksa induciranih interferonom i radujemo se široj upotrebi CLMS-a za identificiranje nove dinamike interakcija proteina u tumorskom mikrookruženju.
Prije nego započne adaptivni imunološki odgovor, urođeni obrambeni sustav domaćina pokreće antimikrobni odgovor posredovan obitelji izlučenih alfa-spiralnih citokina koji se nazivaju interferoni (IFN).Klase IFN tipa I IFNα i IFNβ aktiviraju stanične odgovore, uključujući antivirusna, proapoptotička, proupalna i antiproliferativna stanja.Kod ljudi je poznato 13 podtipova IFNα, svi su grupirani na kromosomu 91. Iznenađujuće, samo je IFNα2 proučavan za kliničku upotrebu.U posljednje vrijeme posebna pozornost posvećena je istraživanju drugih podtipova IFNα.Nedavna studija pokazala je da je IFNα14 jedan od najučinkovitijih izoformi u ograničavanju replikacije HBV2 i HIV-13,4 u usporedbi s kanonskim podtipom IFNα2.
Utvrđeno je da aktivirani interferonski receptorski kompleksi tipa I (IFNAR1 i IFNAR2) pokreću kaskadu prijenosa signala posredovanu Janus kinazama TYK2 i JAK15,6.Ove Janus kinaze fosforiliraju pretvarače signala i aktivatore transkripcijskih proteina (STAT1 i STAT2) na ostacima tirozina kako bi pokrenule heterodimerizaciju6 posredovanu SH2 domenom.Nakon toga, IRF9 veže STAT heterodimere da formira trimerni kompleks IFN-stimuliranog gena faktora 3 (ISGF3), koji se translocira u jezgru i inducira transkripciju više od 2000 interferonom stimuliranih gena (ISG)5,6,7,8.
ISG-ovi čine okosnicu urođenog imunološkog sustava, posebno kao odgovor na virusni napad.Kao prva linija obrane od virusne infekcije, stanice brzo razvijaju opsežne interakcije staničnih proteina sa širokim rasponom bioloških aktivnosti.Ovi proteini uključuju receptore za prepoznavanje uzoraka, signalne molekule, faktore transkripcije i proteine ​​s izravnim antivirusnim funkcijama, kao i negativne regulatore imunoloških odgovora9.Velik dio informacija o aktivnosti ISG-a dolazi iz funkcionalnih pregleda pomoću pregleda prekomjerne ekspresije10,11 ili tehnika utišavanja gena (siRNA, RNAi i CRISPR)12,13 u kojima se pojedinačni ISG-ovi izražavaju ili inhibiraju i njihova se aktivnost testira na različitim virusima.Iako su te studije utvrdile antivirusna svojstva pojedinačnih ISG-a, temeljni molekularni mehanizmi svakog ISG-a ostaju uglavnom nepoznati.Općenito je prihvaćeno da mnogi proteini stupaju u interakciju s jednim ili više citokina kako bi osigurali potpunu aktivnost, tako da ili ISG-ovi međusobno djeluju izravno ili su njihove interakcije posredovane staničnim proteinima.Na primjer, nedavna fotoumrežena proteomska studija identificirala je ATPazu VCP/p97 kao glavnog IFITM3 interakcijskog partnera, čija inhibicija dovodi do nedostataka u lizosomskom razvrstavanju, prometu i kotransportu IFITM3 s virusnim česticama 14 .Koristeći imunoprecipitaciju, identificirali smo VAPA, protein povezan s vezikulama, kao interakcijskog partnera s IFITM1/2/3 koji posreduje sazrijevanje virusa posredovano kolesterolom, a to je potvrđeno drugom studijom koja koristi dvohibridni sustav kvasca.Znanstvena potpora 15 , 16 .
Temeljni biološki proces uključen u suzbijanje infekcije i maligne transformacije je prezentacija antigena, koja je posredovana molekulama glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC).Peptidi (dugi 8-12 aminokiselina) iz odcijepljenih, prerano prekinutih ili pogrešno savijenih proteina učitavaju se u heterodimer MHC-I (koji se sastoji od teških i lakih lanaca MHC-I, nazvan β-2-mikroglobulin; β2M) 17,18.Rezultirajući stabilni MHC-I trimeri transportiraju se na površinu stanice, gdje prezentiraju unutarstanične peptide CD8+ T stanicama (citotoksične T stanice)17.T stanice prepoznaju i uništavaju te patogene i stanice koje nose antigen specifičan za tumor.Posljedično, patogeni i tumorske stanice često potiskuju proces predstavljanja antigena kako bi izbjegli imunološki nadzor.Osim toga, MHC-I je smanjen u 40-90% ljudskih tumora i često je povezan s lošijom prognozom19.
Geni uključeni u odgovor na patogene moraju se brzo prebaciti između stanja mirovanja i stanja aktivne transkripcije.Stoga se pretpostavlja da je nekoliko staničnih proteina uključeno u odgovor na visoku potražnju za IFN-om tijekom kratkih vremenskih razdoblja, uključujući remodeliranje i modifikaciju promotorskog kromatina 20,21.Većina studija usmjerena je na identifikaciju pojedinačnih partnera ISG proteina u prisutnosti IFN-a.Nekoliko proteomskih i transkriptomskih studija na modelnim staničnim sustavima razjasnilo je učinak IFN-a na stanični krajolik.Međutim, unatoč rastućem razumijevanju dinamike inducirane interferonima, još uvijek znamo malo o uključenosti ISG-a.Kada se razmatra složenost i vremenski ovisna dinamika interferonske signalizacije, postavljaju se dva pitanja: (i) je li moguće stabilizirati i uhvatiti multiproteinske komplekse uključene u brzu signalizaciju, i (ii) mogu li se te interakcije preslikati u 3D prostor?
Kako bismo riješili te probleme, implementirali smo kemijsko unakrsno povezivanje posredovano disukcinimidom suberatom (DSS) u kombinaciji s masenom spektrometrijom (CLMS) kako bismo proučili mrežu interakcija proteina izazvanu IFNα i njezinu dinamiku.DSS dodaje kovalentne veze između proksimalnih ostataka proteina i/ili proteinskih kompleksa in vivo.Naknadna MS analiza otkriva specifična mjesta umrežavanja koja odražavaju prostornu blizinu regija unutar određenog proteina, zvanih interne veze, ili podjedinica u proteinskim kompleksima, zvanih međuodnosi.Koristeći ovaj pristup, identificirali smo nekoliko novih kompleksa protein-protein kao i interferonom inducirane multiproteinske interakcijske mreže.Daljnjim testiranjem podskupa ovih novih interakcija, pokazujemo da H2BFS (H2B histonski tip FS; u daljnjem tekstu H2B) i MDN1 djeluju kao partneri za vezivanje za HLA-A.
Stanice Flo-1 jedan su od najpoznatijih in vitro modela adenokarcinoma jednjaka jer oponašaju ključne značajke tumora jednjaka22,23.Međutim, nisu svi tumori imunogeni, a kako bismo odredili odgovaraju li Flo-1 stanice na liječenje interferonom, tretirali smo Flo-1 stanice s 10 ng/ml IFNα tijekom 72 sata.Stanice Flo-1 pokazale su ranu indukciju pSTAT1 i IRF1, počevši 2 sata nakon tretmana i nastavivši se 72 sata, s vremenski ovisnim smanjenjem stacionarnih razina IRF1 (Slika 1A).Utvrđeno je da su ISG-ovi (MX1, IFITM1, OAS1/2 i ISG15) snažno inducirani nakon 6 sati, oponašajući klasične odgovore srednje i kasne faze na IFNα (Slika 1A).Zajedno, ovi podaci sugeriraju da se ovaj stanični model može koristiti za proučavanje odgovora interferona.
Diferencijalni odgovori ekspresije proteina u Flo-1 stanicama nakon tretmana IFNα.(A) Ekspresija proteina u Flo-1 stanicama tretiranim s 10 ng/ml IFNα tijekom 2, 6, 24, 48 i 72 sata analizirana je imunoblotom korištenjem naznačenih ISG antitijela.(B) Coomassie plavo obojeni SDS-PAGE gelovi ekstrakata cijelih stanica nakon unakrsnog povezivanja s DSS-om za navedena vremena i koncentracije.(C) Reprezentativni imunoblot ispitan s p53(DO-1) antitijelom iz istih uzoraka za procjenu stupnja proteinskog unakrsnog povezivanja.
Kako bismo uhvatili krajolik interakcije proteina in situ, upotrijebili smo DSS, naširoko korišteno sredstvo za umrežavanje zbog svoje visoke propusnosti membrane i relativno kratkog vremena reakcije.Kraće vrijeme reakcije pomaže spriječiti stvaranje velikih agregata umreženih proteina, čime se održava stabilnost umreživača.Kako bismo odredili optimalnu koncentraciju DSS-a i izbjegli prekomjerno umrežavanje, prvo smo izložili stanice 5, 2,5 i 1 mM DSS-u tijekom 5, 10, 5 odnosno 30 minuta, te analizirali lizate pomoću Coomassie obojene SDS-PAGE (podaci nisu prikazani) .Čini se da su stanični lizati visoko umreženi pri najnižoj koncentraciji i u najkraćem vremenskom trenutku.Stoga je DSS titriran na 1, 0,5 i 0,1 mM tijekom 5 minuta (Slika 1B).Optimalno umrežavanje promatrano je s 0,5 mM DSS tijekom 5 minuta, a ti su uvjeti odabrani za stanice tretirane s IFNα.Nadalje, Slika 1C prikazuje Western blot analizu izvedenu korištenjem p53 (DO-1) antitijela za procjenu stupnja proteinskog unakrsnog povezivanja.
Flo-1 stanice su tretirane s 10 ng/ml IFNα 24 sata prije dodavanja sredstva za umrežavanje.Umrežene stanice su zatim lizirane proteolizom u dva koraka, a proteini su obrađeni FASP-om (slika 2)24,25.Umreženi triptični peptidi analizirani su spektrometrijom mase (slika 2).MS/MS spektri se zatim uspoređuju sa sekvencom proteina i kvantificiraju pomoću MaxQuant26,27.Umreženi peptidi identificirani su iz dobivenih spektara pomoću programa SIM-XL, a pojedinačni spojevi kombinirani su u složenu mrežu pomoću cjevovoda računalnog softvera otvorenog koda xQuest28 i SIM-XL29 (slika 2).SIM-XL identificira interakcije protein-protein, unutarnje lance i pojedinačne lance u jednostavnim ili složenim smjesama proteina i pruža skripte za vizualizaciju interakcija u strukturama proteina.Osim toga, svaku unakrsnu referencu rangira kao ID rezultat prema kvaliteti MS/MS29 spektra.Identificirano je nekoliko vrlo pouzdanih protein-protein interakcija i kompleksa, a novi skup interakcija dodatno je istražen korištenjem ko-imunoprecipitacije i konformacijskih promjena kompleksa korištenjem modeliranja molekularne dinamike (MD) (Sl. 2) 30, 31.
Shematski prikaz CLMS metode.Flo-1 stanice su tretirane s 10 ng/ml IFNα tijekom 24 sata nakon čega je uslijedilo umrežavanje proteina in situ korištenjem DSS nakon čega je uslijedila liza stanice i tripsinizacija.Umreženi uzorci analizirani su korištenjem Orbitrap masenog spektrometra i dalje uzorkovani za fragmentaciju peptidnih prekursora tijekom LC-MS/MS.Dva povezana peptida identificirana su iz dobivenih spektara pomoću Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL) programa, a svi spojevi su spojeni u složenu mrežu pomoću računalnih cjevovoda.Filtrirajte interakcije niske pouzdanosti na temelju rezultata lažno pozitivne stope (FDR).Nekoliko novih protein-protein interakcija visoke vjernosti dodatno je potvrđeno korištenjem ko-imunoprecipitacije, a konformacijske promjene u kompleksima ispitane su korištenjem modeliranja molekularne dinamike (MD).
Ukupno ~30 500 i ~ 28 500 peptida detektirano je korištenjem MaxQuanta u nestimuliranim i stimuliranim IFNα uzorcima (dodatna tablica S1, slika 3A).Distribucija duljine peptida u oba slučaja pokazala je veći udio većih peptida, što ukazuje na prisutnost umreženih peptida (Slika 3B,C).Osim toga, veći udio većih peptida bio je prisutan u rasponu 40-55 u uzorcima tretiranim IFNα (slika 3C).Mapiranje proteina u odnosu na intenzitet log2 pokazalo je da su klasični proteini stimulirani interferonom bili najobilniji u usporedbi s netretiranim uzorcima, uključujući MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 i HLA-F (Slika 3D).Analiza puteva za proteine ​​koji su više od tri puta obogaćeni kao odgovor na liječenje IFNα korištenjem Reactome baze podataka putova pokazala je da je predstavljanje i obrada antigena posredovana MHC-I najdominantniji put (Slika 3E).U skladu s ranijim izvješćima, antivirusni odgovori posredovani OAS-om i ISG15, kao i IFNα/β i signalizacija citokina bili su među aktiviranim putevima.Osim toga, proteinske poprečne veze specifične za lizin i serin identificirane su iz izvorno dobivenih MS/MS spektara korištenjem SIM-XL.Nedavna studija izvijestila je o 104 ISG-a koji obuhvaćaju 20 virusa iz 9 klasa virusa meta-analizom pojedinačnih studija prekomjerne ekspresije ISG-a u 5 tipova stanica9.Međutim, kako bismo prevladali računalna ograničenja pregleda velikih skupova podataka, započeli smo s manjim skupom podataka kako bismo istražili moguće interakcije između popisa IRDS gena koje su objavili Padaria i sur., od kojih su većina ISG-ovi.
Identifikacija različito izraženih umreženih proteina kao odgovor na IFNα (podaci dobiveni od MaxQuant).(A) Vennov dijagram koji predstavlja broj uobičajenih i isključivih peptida identificiranih u uzorcima Flo-1 tretiranim i netretiranim IFNα14.Distribucija duljine peptida netretiranih (B) i IFNα tretiranih (C) umreženih uzoraka.(D) Toplinska karta koja predstavlja log2 (LFQ intenzitet) između netretiranih i IFNα14 tretiranih Flo-1 stanica.Lijeva ploča prikazuje proteine ​​koji se najaktivnije aktiviraju u prisutnosti IFNα.(E) Histogram koji predstavlja 20 glavnih putova obogaćivanja nakon tretmana IFNα.Baza podataka puta Reactome analizirala je više od četiri puta promjene u reguliranim proteinima koji reagiraju na IFNα.
ISG stimulacija posredovana interferonom dobro je dokumentirana, ali na molekularnoj razini slabo se razumije kako ti proteini kulminiraju u širokom rasponu bioloških funkcija.Istraživali smo interakcije proteina s visokim stupnjem pouzdanosti između poznatih ISG-ova.Zanimljivo je da smo identificirali mrežu koja uključuje proteine ​​MX1, USP18, ROBO1, OAS3 i STAT1 koji tvore veliki kompleks kao odgovor na liječenje IFNα (Slika 4, Tablica S2) 32,33,34.Najvažnije je da su te interakcije pronađene u svim triplikatima tretiranim s IFNα i nisu pronađene u netretiranim uzorcima, što sugerira da su nastale specifično kao odgovor na tretman s IFNα.Poznato je da STAT1 transkripcijski regulira ekspresiju ovih ISG-ova, ali njegova interakcija s ISG-ima na razini proteina nije proučavana.Kristalna struktura STAT1 pokazala je da njegova spiralna domena (CCD) nije uključena u interakciju s DNA ili protomerima tijekom formiranja dimera35.Ove α-spirale tvore strukturu spiralne spirale koja osigurava pretežno hidrofilnu površinu za pojavu interakcija 35 .U našim CLMS podacima primijetili smo da se većina interakcija sa STAT1 dogodila u SH2 domeni koja prethodi CCD-u, povezničkoj domeni ili C-terminalnom repu (ostaci 700-708) (Slika 4A).Prethodna studija je objavila da se USP18 veže na CCD i DNA-vezujuću domenu (DBD) STAT2 i regrutira se na podjedinicu interferonskog receptora tipa I IFNAR2 da posreduje u inhibiciji signalizacije interferona tipa I 24 .Naši podaci su također pokazali da katalitička domena USP18 stupa u interakciju sa STAT1 DBD (Slika 4A,D), sugerirajući da i STAT1 i STAT2 mogu igrati ulogu u privlačenju USP18 za IFNAR2.
Protein-protein ISG mreža identificirana u umreženim stanicama tretiranim s IFNα.(A) 2D dijagram interakcija koji prikazuje interakcije protein-protein (generirane u programu SIM-XL), s linijama koje predstavljaju međumolekularne interakcije (granična granica umreženosti postavljena na 3,5).Domene različitih identiteta označene su bojom32: MX1 domena, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) i GED (569–660).OAS3 domene: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) i OAS1_C (903-108).Domena ROBO1, Ig_3 (67-151), I-set (170-258), I-set (262-347), Ig_3 (350-432), Ig_3 (454-529), fn3 (562-646), fn3 (678–758) i fn3 (777–864).STAT1 polja: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) i STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Kružni preglednik umreženih proteina (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 i STAT1) s interakcijama i interakcijama označenim plavom i crvenom bojom.Prag unakrsne veze postavljen je na 3,5.Točkasti dijagrami pokazuju mjesta interakcije STAT1 s MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) i OAS3 (F), kao i mjesta interakcije K ili S između dva peptida.Na slici je prag rezultata unakrsnog povezivanja postavljen na 3,0.(G) Različita mjesta interakcije između STAT1 i OAS3 DI domena superponiranih na njihove proteinske strukture u PyMol (PyMOL sustav molekularne grafike, verzija 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) i OAS3 (pdb id: 4s3n34).) program.
Dvije izoforme USP18 opisane su kod ljudi, protein pune duljine koji je pretežno smješten u jezgri, i izoforma bez N-terminalne domene, USP18-sf, koja je ravnomjerno raspoređena u citoplazmi i jezgri 36 .Osim toga, predviđeno je da je N-kraj nestrukturiran i da ne zahtijeva aktivnost izopeptidaze ili vezanje ISG1537.Većina interakcija identificiranih u našoj studiji nalazila se na N-kraju proteina, što sugerira da te interakcije uključuju USP18 pune duljine (Slika 4A, D) i stoga se vjerojatno javljaju u jezgri.Štoviše, naši podaci također pokazuju da je N-kraj specijaliziran za interakcije protein-protein.Vezno mjesto IFNAR2 nalazi se između ostataka 312-368, a osobito se nijedan od proteina u kompleksu ne veže za ovu regiju (Sl. 4A) 37,38.Ovi podaci uzeti zajedno pokazuju da veznu domenu IFNAR2 koristi isključivo receptorski protein.Nadalje, samo su OAS3 i ROBO1 bili povezani s domenama uzvodno od N-kraja i veznog mjesta IFNAR2 (Slika 4A).
ROBO1 pripada imunoglobulinskoj (Ig) superobitelji transmembranskih signalnih molekula i sastoji se od pet Ig domena i tri fibronektinske (Fn) domene u izvanstaničnoj regiji.Nakon ovih izvanstaničnih domena slijedi proksimalna regija membrane i jedna transmembranska spirala 39. Nestrukturirana intracelularna regija nalazi se na C-kraju i sadrži očuvane sekvencijske motive koji posreduju u vezivanju efektorskog proteina39.Regija koja se proteže od aminokiselina ~1100 do 1600 uglavnom je neuređena.Otkrili smo da MX1 stupa u interakciju s ROBO1 putem Ig, Fn i unutarstaničnih domena, dok se većina interakcija sa STAT1 događa između njegove CCD domene poveznice i C-kraja ROBO1 (Slika 4A,E).S druge strane, interakcije s DI, DIII i OAS3 veznim regijama bile su raspoređene kroz ROBO1 protein (Sl. 4A).
Obitelj proteina oligoadenilatne sintaze (OAS) prihvaća i veže unutarstaničnu dvolančanu RNA (dsRNA), prolazi kroz konformacijske promjene i sintetizira 2',5'-povezane oligoadenilate (2-5 As) 40 .Utvrđeno je da među tri OAS-a, OAS3 pokazuje najveći afinitet za dsRNA i sintetizira najmanju količinu 2-5 As, koji može aktivirati RNazu L i time ograničiti replikaciju virusa 41 .Porodica OAS sastoji se od domena nukleotidnih transferaza sličnih polimerazi beta (pol-β).Prethodna istraživanja su pokazala da katalitička aktivnost C-terminalne domene (DIII) ovisi o dsRNA-vezujućoj domeni (DI), koja je potrebna za aktivaciju OAS342.Uočili smo da DI i DII domene OAS3 stupaju u interakciju s CCD-om i malom spojnom regijom između SH2 i STAT1 TAD (Slika 4A, F).Prekrivanje različitih mjesta za umrežavanje na proteinskoj strukturi otkrilo je interakciju između β-ploče i DBD STAT1 petlje i otvorenog džepa ili šupljine koju tvore ostaci 60-75 u DI domeni OAS3 (Slika 4G).Orijentacija proteina u kompleksu također je pokazala da niti jedna interakcija s OAS3 nije ometala sposobnost vezanja DNA njegove DI domene (Sl. S1A).Osim toga, N-terminalna domena GTPaze MX1 u velikoj je interakciji s DI i DIII domenama OAS3 (slika 4A).Također smo primijetili interakciju između OAS1 i MX1 u sva tri ponavljanja tretirana IFNα, gdje je jedna domena OAS1 (također katalitički aktivna) djelovala u interakciji sa sve tri domene MX1 (Slika S2A,B).
MX proteini dio su velike obitelji GTPaza sličnih dineinu koje sadrže N-terminalnu domenu GTPaze koja veže i hidrolizira GTP, intermedijarnu domenu koja posreduje u samosastavljanju i C-terminalni leucinski zatvarač koji djeluje kao GTPaza (LZ ).domena efektorska domena25,43.MX1 se veže na podjedinice virusnih polimeraza kako bi blokirao transkripciju virusnog gena43.Prethodno objavljen dvohibridni pregled kvasca pokazao je da MX1 povezan s PIAS1 inhibira STAT1-posredovanu aktivaciju gena blokiranjem aktivnosti vezanja DNA i također ima aktivnost SUMO E344,45 ligaze.Ovdje pokazujemo da se MX1 veže za STAT1 (Slika 4C, D), međutim kako ova interakcija utječe na STAT1-posredovanu aktivaciju gena kao odgovor na IFNα potrebno je dodatno proučavati.Osim toga, također smo otkrili da MX1 stupa u interakciju s IFIT3 i DDX60 u sva tri ponavljanja tretirana IFNα (slika S2C).
DDX60 je IFN-inducirana citoplazmatska helikaza za koju je ranije objavljeno da igra ulogu u RIG-I neovisnoj razgradnji virusne RNA46.Interakcija je s RIG-I i aktivira njegovu signalizaciju na ligand-specifičan način 46. DDX60 se sastoji od DEXD/H-Box domene helikaze i C-terminalne domene helikaze koje vežu virusnu RNA i DNA47.Većina njegovih interakcija s MX1 i IFIT3 događa se unutar dugih N- i C-terminalnih regija bez kanonskih domena ili motiva (sl. S2E, F).Međutim, MX1 je također povezan s domenom helikaze DEXD/H-Box (slika S2E).Proteini iz obitelji IFIT imaju tandemske kopije karakterističnog motiva helix-turn-helix koji se naziva tetrapeptidno ponavljanje (TPR).Utvrđeno je da je IFIT3 pozitivan modulator RIG-I signalizacije i stoga komponenta kompleksa MAVS.Uzeti zajedno, naši podaci sugeriraju da IFIT3 i DDX60 primarno djeluju u regiji između TPR 3-6 IFIT3 i mogu igrati ulogu u RIG-I/MAVS signalizaciji (Sl. S2F).
S obzirom na to da je probir cijelog proteoma računalno intenzivan, zatim smo pregledali cijelu ljudsku UniProt bazu podataka na prisutnost jednog od ponavljanja tretiranih IFNα.U ovoj replici pronašli smo nekoliko vrlo pouzdanih mreža interakcije za HLA-A.Analiza proteinskih putova identificiranih pomoću MS/MS spektra pokazala je da je obrada i prezentacija antigena temeljena na MHC-I glavni put induciran interferonom (Slika 3D).Stoga smo se usredotočili na proučavanje proteinskih interakcija molekula MHC-I s visokim stupnjem pouzdanosti u svim umreženim uzorcima.HLA se sastoji od α1, α2 i α3 domena i lakih lanaca, a mikroglobulin β2 (β2m) je konstantni šaperon protein49.Jednom kada se skupi u endoplazmatskom retikulumu, HLA je nestabilan u odsutnosti peptidnih liganada50.Utor za vezanje peptida formiran je od visoko polimorfnih i nestrukturiranih α1 i α2 domena u nepeptidnom obliku i relativno manje polimorfne α351 domene.U prisutnosti IFNα detektirali smo dva kompleksa HLA-A: jedan stupa u interakciju s HMGA1 i H2B (Slika 5, Tablica S3), a drugi stupa u interakciju s MDN1, LRCH4 i H2B (Slika 6).
IFNα inducira mrežu interakcije HLA-A s H2B (H2BFS) i HMGA1.(A) 2D dijagram (generiran u softveru SIM-XL) koji prikazuje različite vrste interakcija u kompleksu H2B-HLA-A-HMGA1: međuveza (plava), međuveza (crvena) i jedna veza (crna)..Domene različitih identiteta označene su bojama32: H2B (histonski; 2–102) i MHC-I (MHC_1; 25–203, skupina C1; 210–290 i MHC_I_C; 337–364).Prag unakrsne veze postavljen je na 3,5.Točkasti dijagrami pokazuju mjesta interakcije HLA-A s H2B (B) i HMGA1 (C), kao i mjesta interakcije K ili S između dva peptida.Na slici je prag rezultata unakrsnog povezivanja postavljen na 3,0.(D) Odnosi između proteina prikazani u strukturama proteina H2B, HLA-A i HMGA1 u programu PyMOL.Ove su strukture modelirane pomoću poslužitelja Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), a predloške strukture za proteine ​​H2B, HLA-A i HMGA1 bile su 1kx552, 1kj349 i 2eze55, respektivno.
IFNα inducira mrežu interakcije HLA-A s H2B (H2BFS), MDN1 i LRCH4.(A) Intramolekularne (crvene) i intermolekularne (plave) poprečne veze prikazane na 2D interaktivnoj karti (generiranoj u SIM-XL softveru) s MDN1 predstavljenim kao krug.Prag unakrsne veze postavljen je na 3,5.Domene različitih identiteta označene su bojama32: H2B (histonski; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, skupina C1; 210–290 i MHC_I_C; 337–364) i LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) i CH (535–641)).(B) Odnosi između proteina prikazani u strukturama proteina H2B, HLA-A, LRCH4 i MDN1 u programu PyMOL.Ove su strukture modelirane korištenjem poslužitelja Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) sa predložnim strukturama 1kx552, 1kj349, 6hlu62 i 6i2665 za proteine ​​H2B, HLA-A, LRCH4 i MDN1, odnosno.Točkasti dijagrami koji pokazuju mjesta interakcije K ili S za HLA-A s H2B (C), LRCH4 (D) i MDN1 (E).Za plohe, prag rezultata unakrsnog povezivanja postavljen je na 3,0.
Osim u održavanju integriteta genoma, histon H2B također je uključen u regulaciju transkripcije.Protein H2B sastoji se od središnje histonske domene (HFD) koju tvore tri α-spirale odvojene petljama i C-terminalni rep 41,52.Većina interakcija s H2B događa se u α1 spirali, koja osigurava trimerizaciju s HFD heterodimerom (sl. 5A, B).Iako su lizini uključeni u vezanje DNA, neki lizini su također alternativna mjesta acetilacije ili metilacije.Na primjer, ostaci K43, K46 i K57 iz H2B nisu uključeni u izravno vezanje DNA, ali su mete raznih posttranskripcijskih modifikacija53.Slično, ostaci K44, K47 i K57 u H2B mogu igrati alternativnu ulogu u prisutnosti IFNα, uključujući interakcije s drugim proteinima (Slika 5A, B).Osim toga, ekstrakromosomski histon H2B aktivira imunološki odgovor u različitim tipovima stanica, djelujući kao citosolni senzor za otkrivanje fragmenata dvolančane DNA (dsDNA) koji potječu od uzročnika infekcije ili oštećenih stanica54.U prisutnosti DNA virusa, deplecija H2B inhibirala je proizvodnju IFN-β i fosforilaciju STAT154.Također je poznato da H2B ulazi i izlazi iz jezgre brže od drugih histona jezgre54.Interakcije H2B s MDN1 i LRCH4 također su opažene u odabranim netretiranim uzorcima.Otkrili smo da je HLA-A u interakciji s H2B u sva tri uzorka tretirana IFNα i u jednom netretiranom ponovljenom uzorku.Ovi podaci odražavaju ulogu H2B u alternativnoj fiziološkoj funkciji neovisnoj o regulaciji transkripcije.
HMGA1 (high mobility group AT-Hook 1), mali nukleoprotein bogat aminokiselinama koje potiču bolest, identificiran je u povezanosti s HLA-A.Ima kiseli C-terminalni rep i tri različita DBD-a koja se nazivaju AT kuke jer se vežu za manji žlijeb regije bogate AT-om u dsDNA55,56.Ovo vezanje uzrokuje savijanje ili ispravljanje DNK, dopuštajući kanonskim transkripcijskim faktorima pristup njezinoj konsenzusnoj sekvenci.Vjeruje se da je C-terminalni rep uključen u interakcije protein-protein i regrutiranje transkripcijskih faktora, budući da delecijski mutanti C-terminala ne mogu započeti transkripciju57.Štoviše, ova domena sadrži nekoliko očuvanih fosforilacijskih mjesta koja su poznati supstrati za kinaze 58 .Promatrali smo HLA-A i H2B interakcije s HMGA1 izvan C-terminalne domene, sugerirajući da se C-terminalna domena uglavnom koristi za vezanje faktora transkripcije (Sl. 5A, C).HMGA proteini se natječu s histonom H1 za vezanje na adaptorsku DNA, čime se povećava dostupnost57.Slično, čini se vjerojatnim da HMGA stupa u interakciju s histonom H2B duž DNK poveznice u konkurenciji s histonom H1.HMGB1 inducira ekspresiju HLA-A, -B i -C u dendritskim stanicama, što dovodi do njihove aktivacije59, ali interakcija između HMG i HLA nije prethodno prijavljena.Otkrili smo da HMGA1 stupa u interakciju s α1 i α3 domenama HLA-A, s većinom interakcija izvan svoje 3 DBD (Slika 5A,C).U našim rukama, utvrđeno je da je HLA-A lokaliziran u jezgri (podaci nisu prikazani), a s obzirom da su H2B i HMGA1 također prisutni u jezgri, ova interakcija se vjerojatno događa u jezgri.Specifični adukti izmjereni između H2B, HLA-A i HMGA1 prikazani su na slici 5D.
Većina interakcija HLA-A s drugim proteinima događa se unutar njegovih α1 i α2 domena i neuređene C-terminalne domene (slika 6).U jednom od ovih primjera otkrili smo da HLA-A stupa u interakciju s poremećenim N-terminalnim repom LRCH4 (Slika 6A,D).LRCH4 regulira aktivaciju TLR4 i indukciju citokina LPS, čime modulira urođeni imunološki odgovor60,61.To je membranski protein s devet ponavljanja bogatih leucinom (LRR) i homološkim motivom kalmodulina (CH) u svojoj ektodomeni, nakon čega slijedi transmembranska domena (TMD) 60, 62.Prijavljeno je da CH domene posreduju u interakcijama protein-protein 60 .Dio od oko 300 aminokiselina između LRR i CH domena je relativno dostupan, ali neuredan.Na temelju funkcije neuređenih regija kao medijatora protein-proteinskih mreža i vezikularnog transporta 63, otkrili smo da se većina proteinskih interakcija događa u neuređenim regijama.Interakcije s MDN1 bile su raspoređene po cijeloj dužini proteina, uključujući LRR1, LRR6, CH domene i nasumične regije, dok je H2B uglavnom vezan za CH domenu (Sl. 6A, B).Značajno je da niti jedna interakcija nije uključivala TMZ, što ukazuje na specifičnost CLMS pristupa (Slika 6A, B).
MDN1 je također identificiran kao dio HLA-A proteinske mreže (Slika 6A).Pripada AAA obitelji proteina (ATPaze povezane s različitim aktivnostima).Ovo je ista N-terminalna AAA domena koja se organizira u heksamerni prsten i uklanja faktor okupljanja iz 60S 64 ribosomske podjedinice.čini se da je sličan dyneinu64,65,66.Osim toga, područje bogato Asp/Glu prati MIDAS domena (mjesto ovisno o metalnim ionima).Zbog velike veličine MDN1 (otprilike 5600 aminokiselina) i njegove ograničene homologije s dobro proučenim proteinima, malo se zna o njegovoj strukturi i funkciji kod ljudi.Identificirali smo HLA-A, H2B i LRCH4 kao partnere za vezanje MDN1 i otkrili njihovu orijentaciju kao proteinskih kompleksa u PyMolu (Slika 6A,B).Ova tri proteina stupaju u interakciju s AAA domenom, dynein-sličnom povezničkom domenom i vjerojatno MIDAS MDN1 domenom.U prethodnom izvješću, afinitetno pročišćavanje proteina mamaca identificiralo je MDN1 kao protein povezan s histonom H2B67.Osim toga, nedavna studija također je izvijestila o interakciji između MDN i HLA-B u HCT116 stanicama pomoću afinitetno pročišćene masene spektrometrije, podupirući naše nalaze68.Identifikacija ovog kompleksa u uzorcima tretiranim IFNα ukazuje na ulogu MDN1 u signaliziranju interferona.
Budući da su HLA geni vrlo polimorfni, izdvojili smo očitavanja sekvenciranja mapiranja HLA-A, -B i -C iz podataka sekvenciranja RNA Flo-1 stanica (podaci nisu prikazani).Peptidne sekvence u skladu s očitanjem sekvenciranja otkrile su značajne razlike između HLA-A, -B i -C u regijama gdje su umreženi peptidi smješteni u HLA-A (Slika S3).Osim toga, nismo uočili protein-protein unakrsno povezivanje HLA-B/C molekula s H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 proteinima.Ovo sugerira da je proteinska interakcija između HLA-A, MDN1, LRCH1 i HMGA1 specifična za HLA-A.Osim toga, proteomska analiza neumreženih uzoraka (Tablica S4) pokazala je da HLA-A ima veću pokrivenost sekvence u usporedbi s HLA-B ili HLA-C.Peptidi identificirani za HLA-A bili su visokog intenziteta u uzorcima tretiranim IFNα i netretiranim uzorcima.
Kako bismo osigurali da ovdje identificirane interakcije nisu posljedica nespecifičnog unakrsnog povezivanja dvaju proteina u neposrednoj prostornoj blizini, dodatno smo potvrdili dva nova faktora interakcije s HLA-A izvođenjem testova koimunoprecipitacije.Interakcije HLA-A s endogenim MDN1 i H2B otkrivene su u Flo-1 stanicama tretiranim i netretiranim IFNα (Slika 7, Slika S4).Potvrdili smo da je HLA-A zarobljen od strane H2B u imunoprecipitatima i da je ta povezanost nastala zbog tretmana IFNα jer HLA-A nije bilo u uzorcima imunoprecipitata iz netretiranih stanica (Slika 7A).Međutim, naši podaci sugeriraju da IFNα različito regulira vezanje HLA-A na H2B i MDN1.IFNα inducira povezanost između H2B i HLA-A, ali smanjuje njegovu povezanost s MDN1.Otkrili smo da je MDN1 bio povezan s HLA-A u kontrolama, a dodatak IFNα smanjio je ovu interakciju neovisno o indukciji MDN1 pomoću IFNα (Slika 7B,C).Osim toga, imunoprecipitacija HLA-A uhvatila je H2B u stanicama A549 (Sl. S4), sugerirajući da je ova interakcija neovisna o tipu stanice.Uzeti zajedno, ovi rezultati podržavaju interakcije HLA-A s H2B i MDN1 posredovane interferonom.
HLA-A supročišćava H2B i MDN1.Reprezentativni endogeni H2B (A) i MDN1 (B) imunoblotovi imunoprecipitirani su iz Flo-1 stanica tretiranih IFNα i testirani na naznačena antitijela.IgG miša i kunića korišteni su kao negativna kontrola.(C) Relativne količine (unos) različitih antigena prikazane su imunoblotovima testiranim na naznačena antitijela, β-aktin je korišten kao kontrola opterećenja.
Istražena su strukturna svojstva jedne od interferonom izazvanih visoko pouzdanih umreženih mreža, H2B-HLA-A-HMGA1.Koristili smo modeliranje molekularne dinamike kao alternativni pristup za razumijevanje konformacijske dinamike proteina uključenih u ovaj kompleks (Slika 8).Zaključci iz CLMS podataka ukazuju na mogućnost različitih konformacija proteina H2B, HLA-A i HMGA1.Stoga su sljedeći potencijalni kompleksi modelirani u mediju otapala: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A i H2B-HLA-A-HMGA1.Inicijalni ekran za spajanje protein-protein pomoću paketa MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) sugerirao je moguće konformacije koje se razlikuju između ovih proteina (slika 8A).Vizualizacija docking proteinskog kompleksa otkrila je nekoliko interakcija i mogućih konformacija (Slika 5A, 8).Stoga je jedna moguća konformacija prikazana na slici 8A (s označenim unakrsnim vezama) i dodatno je procijenjena korištenjem cjevovoda za modeliranje MD.Osim toga, vezanje H2B ili HMGA1 na HLA-A naglašava veći afinitet H2B za HLA-A (Slika 8A).
Konformacijska dinamika mogućih mreža između kompleksa H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A i H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Lijevi panel je 2D mapa (generirana u softveru SIM-XL) intramolekularnih (crveno) i međumolekularnih (plavo) poprečnih veza (granična vrijednost poprečnih veza postavljena je na 3,5).Osim toga, identificirani ostaci umreženja označeni su na strukturama proteina H2B, HLA-A i HMGA1.Povezane konformacije ovih proteina ekstrahirane su pomoću docking cjevovoda implementiranog u MOE paket.Donji lijevi panel prikazuje različite moguće konformacije kompleksa H2B-HLA-A i HMGA1-HLA-A s različitim afinitetima vezanja protein-protein (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Standardna devijacija (RMSD) položaja atoma (isključujući atome vodika) za svaku strukturu proteina.(C) Međumolekularne interakcije protein-protein vodikove veze iz različitih simuliranih kompleksa uzimajući u obzir specifične interakcije trajanja ≥ 10 ns.Odsječna udaljenost donor-akceptor h-veze postavljena je na 3,5 Å, a kut odsjeka donor-H-akceptor postavljen je na ≥ 160°–180°.(D) Označeni ostaci koji tvore interakcije HLA-A protein-protein sa svojim odgovarajućim partnerima, u rasponu od ≥ 20 ns, ekstrahirani iz lažnih kompleksa HLA-A-H2B i HLA-A-HMGA1.Proteinske strukture predstavljaju prosječnu strukturu od 100 ns MDS.(E) Interakcije između kompleksa HLA-A-H2B i HLA-A-HMGA1 u usporedbi s interakcijama praćenim simulacijom H2B-HLA tijekom 100 ns na temelju K ili S mjesta interakcije između dva peptida.Kompleksi /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Vrijednost praga za procjenu unakrsnih veza postavljena je na 3,0, a specifične interakcije iz MDS-a uz ≥ 10 ns su uzete u obzir.Proteinske strukture vizualizirane su pomoću paketa BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, SAD) i Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
Stabilnost molekula HLA-A tijekom vremena (standardna devijacija; RMSD ili standardna devijacija; RMSF) ukazuje da je prisutnost H2B ili HMGA1 proteina u kompleksima stabilizirala HLA-A (Slika 8B, Slika S5).Protein HMGA1 čvrsto se veže za B2M mjesto HLA-A, inducirajući stabilnost HLA-A aminokiselina u kompleksu HLA-A-HMGA1 ili H2B-HLA-A-HMGA1 (Slika 8B, Slika S5).posebno, pronađeno je da su HLA ostaci ~60-90 i ~180-210 manje fleksibilni u prisutnosti H2B (Slika 8B).H2B i HMGA1 pokazali su bolje vezanje na HLA-A u kompleksu H2B-HLA-A-HMGA1 u usporedbi s vezanjem HLA-A samo na H2B ili HMGA1 (Slika 8C, D; Tablica S5).Ostaci uključeni u vodikovu vezu (MD modelirana visoka popunjenost ≥ 10 ns) podudaraju se s CLMS mjestima interakcije (K ili S ostaci) u kompleksu, što sugerira da su interakcije identificirane pomoću CLMS vrlo pouzdane.Pouzdanost (Sl. 8E).U CLMS i MD modeliranju, utvrđeno je da HLA-A ostaci između oko 190-210 i oko 200-220 aminokiselina vežu H2B odnosno HMGA1 (SLIKA 8E).
Interakcije protein-protein tvore dinamičke strukturne mreže koje posreduju u unutarstaničnoj komunikaciji kao odgovor na određene podražaje.Budući da mnogi pristupi proteomike otkrivaju promjene u ukupnoj razini stabilnog stanja proteina, dinamika interakcije protein-protein zahtijeva dodatne alate za hvatanje sučelja vezanja, a CLMS je jedan takav alat.Interferonski signalni sustav je mreža citokina koja omogućuje stanicama da odgovore na niz okolišnih patogenih i intrinzičnih patoloških signala, što kulminira indukcijom podskupa proteina induciranih interferonom.Primijenili smo CLMS kako bismo utvrdili mogu li se identificirati nove interakcije protein-protein među panelom proteina induciranih interferonom.Globalna analiza umrežavanja proteina u modelu Flo-1 stanica koje reagiraju na interferon korištena je za hvatanje proteinskih kompleksa.Ekstrakcija triptičkih peptida iz umreženih i umreženih stanica omogućuje brojanje peptida, obogaćivanje puta i distribuciju duljine peptida s definiranim LFQ intenzitetom.Kanonski proteini inducibilni interferonom identificirani su kao pozitivna unutarnja kontrola, dok su uočeni novi intermolekularni i intramolekularni umreženi adukti kanoničkih proteina inducibilnih interferonom kao što su MX1, UP18, OAS3 i STAT1.Istražuju se različite strukturne značajke i interakcije u funkcionalnim područjima.
Interakcija između HLA-A, MDN1 i H2B otkrivena je imunoblotingom u stanicama Flo-1 i A549 tretiranim i netretiranim IFNα.Naši rezultati naglašavaju da HLA-A stvara kompleks s H2B na način ovisan o IFNα.Naš rad predstavlja zanimljiv put za daljnje istraživanje ko-lokalizacije ova dva kompleksa.Također bi bilo zanimljivo proširiti CLMS pristup na panel staničnih linija kako bi se identificirale interakcije proteina posredovane interferonom neovisne o tipu stanice.Konačno, upotrijebili smo MD modeliranje kao alternativni pristup za razumijevanje konformacijske dinamike proteina uključenih u kompleks H2BFS-HLA-A-HMGA1, koji je pratio intramolekularne i intermolekularne preslušavanja.Zaključci iz CLMS podataka ukazuju na mogućnost različitih konformacija proteina H2BFS, HLA-A i HMGA1.Moguće različite konformacije između ovih docking proteinskih kompleksa otkrile su nekoliko interakcija sličnih onima opaženim u CLMS skupu podataka.Jedna od glavnih prednosti naše metode je ta što omogućuje jednostavnu identifikaciju međudjelovanja visoko polimorfnih gena kao što je HLA, pa će biti zanimljivo proučavati interakcije proteina specifičnih za HLA haplotip koje je inače teško proučavati.Uzeti zajedno, naši podaci pokazuju da se CLMS može koristiti za proširenje našeg razumijevanja signalnih mreža induciranih interferonom i pružiti osnovu za proučavanje složenijih međustaničnih sustava u mikrookruženju tumora.
Flo-1 stanice su dobivene od ATCC i održavane u DMEM (Gibco) s dodatkom 1% penicilina/streptomicina (Invitrogen), 10% fetalnog goveđeg seruma (Gibco) i pohranjene na 37°C i 5% CO2.Inkubacija.Stanice su uzgojene do 70-80% konfluencije prije nego što su tretirane s IFNα14 (proizvedeno od strane Edinburgh Protein Production Facility).Sve druge kemikalije i reagensi kupljeni su od Sigma Aldrich osim ako nije drugačije navedeno.
Flo-1 stanice su uzgajane u pločama sa 6 jažica i sljedećeg dana stanice su tretirane s 10 ng/ml IFNα14 tijekom 24 sata do približno 80% konfluencije.Stanice su isprane tri puta s PBS-om i vezane sa svježe pripremljenim DSS-om (Thermo Fisher Scientific) (otopljenim u DMSO) u PBS-u tijekom 5 minuta na 37°C do konačne koncentracije od 0,5 mM.DSS reakcija umrežavanja zamijenjena je PBS-om, a zaostali DSS je ugašen dodavanjem 20 mM Tris (pH 8,0) u PBS tijekom 15 minuta na 37°C.Stanice su sakupljene struganjem i sakupljene u epruvetama sa slabim vezivanjem (Axygen).
Stanični talog je liziran s 300 µl pufera za lizu uree (8 M urea, 0,1 M Tris, pH 8,5) 30 minuta na sobnoj temperaturi uz povremeno mućkanje.Svi koraci centrifugiranja su izvedeni na 14,000 xg na 8°C.Centrifugirajte lizat 10 minuta i prenesite supernatant u novu epruvetu.Preostale bistre čestice otopljene su u 150 μl drugog pufera za lizu (2 M urea, 2% (w/v) SDS (natrijev dodecil sulfat)) 30 minuta ili više dok nije dobivena homogena vodena otopina.Lizat je centrifugiran 20 minuta i supernatant je pomiješan s lizatom dobivenim u prethodnom koraku.Koncentracije proteina procijenjene su korištenjem Micro BCA testa (Thermo Fisher Scientific) prema uputama proizvođača za postupke mikropločica.Uzorci su brzo zamrznuti u tekućem dušiku i pohranjeni na -80°C.
Otprilike 100 μg topljivog umreženog proteina obrađeno je korištenjem modificiranog protokola za pripremu uzorka filtracije (FASP) kako su opisali Wisniewski i sur.69 Ukratko, protein je umrežen s 200 µl urea pufera (8 M urea u 0,1 M Tris, pH 8,5), vorteksiran i prepolovljen.Svi koraci centrifugiranja su izvedeni na 14,000 xg na 25°C.Prva polovica umreženog proteinskog lizata prenesena je u 10 kDa Microcon centrifugalni filterski uređaj opremljen Ultracel-10 membranom (Merck), nakon čega je uslijedilo centrifugiranje na filteru tijekom 25 minuta.Zatim dodajte drugu polovicu proteina u filtar i ponovite iste korake.Oporavak proteina proveden je dodavanjem 100 μl 17 mM tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorida (TCEP) u urea puferu.Rekuperacija je miješana na termomikseru pri 600 rpm tijekom 30 minuta na 37°C.Dodatno, kolona je centrifugirana i reducirani umreženi protein je alkiliran upotrebom 100 μl 50 mM jodoacetamida u puferu uree.Reakcija alkilacije je provedena na sobnoj temperaturi 20 minuta u mraku.Okrenite kolonu, isperite stijenke kolone 3 puta sa 100 µl pufera uree, a zatim centrifugirajte.Ista operacija je izvedena 3 puta upotrebom 100 μl 100 mM amonijevog bikarbonata.Prije tripsinizacije zamijenite epruvetu za prikupljanje novom.Dodajte pufer za probavu koji sadrži 50 mM amonijevog bikarbonata i 1 µl tripsina razrijeđenog u puferu za tripsin (Promega).Omjer tripsina i proteina je održavan na oko 1:33, a probavne reakcije su inkubirane preko noći na 37°C u vlažnoj komori.Umreženi peptid je eluiran iz filtera centrifugiranjem 25 minuta.Oporavak peptida poboljšan je dodavanjem 50 μl 0,5 M NaCl u filter, nakon čega je uslijedilo centrifugiranje 25 minuta.
C18 Micro Spin kolone (Harvard Apparatus) korištene su za odsoljavanje umreženih triptičkih peptida prema protokolu koji su opisali Bouchal et al.70 uz manje modifikacije.Ukratko, C18 centrifugalne kolone su aktivirane s tri ispiranja 0,1% mravlje kiseline (FA) u acetonitrilu (AcN) (Merck) i dva ispiranja 0,1% FA.Kolona je hidratizirana s 0,1% FA tijekom 15 minuta.Stavite uzorke u centrifugalne kolone i isperite 3 puta s 0,1% FA.Odsoljeni peptidi su sekvencijalno eluirani postupnim gradijentom koristeći 50%, 80% i 100% AcN u 0,1% FA.Uzorci su sušeni u SpeedVac Plus koncentratoru (Eppendorf) dok zaostala tekućina nije potpuno nestala.Eluirani peptidi su otopljeni u 100 µl 0,08% trifluorooctene kiseline u 2,5% AcN i koncentracije su izmjerene na NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Otprilike 1 μg umreženog peptida po uzorku ubrizgan je u LC-MS/MS sustav.
Umreženi peptidi razdvojeni su na UltiMate 3000 RSLCnano LC sustavu (Thermo Scientific) spojenom na Orbitrap Exploris 480 maseni spektrometar (Thermo Scientific).Umreženi peptidi sakupljeni su na 300 µm ID, 5 mm dugoj µ-pre-koloni C18 capture koloni napunjenoj sa C18 PepMap100 sorbentom i 5 um PepMap sorbentom (Thermo Scientific).Napunite set protoka pumpe na 5 µl/min 0,08% trifluorooctene kiseline otopljene u 2,5% AcN.Umreženi peptidi odvojeni su na analitičkoj stopljenoj koloni silicijevog dioksida s unutarnjim promjerom od 75 μm i duljinom od 150 mm, napunjenoj 2 μm PepMap sorbentom (Thermo Scientific).Mobilne faze A i B sastojale su se od 0,1% FA u vodi odnosno 0,1% FA u acetonitrilu.Gradijent počinje od 2,5% B i povećava se linearno do 40% B tijekom 90 minuta, zatim do 90% B tijekom sljedeće 2 minute.Sastav mobilne faze je održavan na 90% B tijekom 10 minuta, a zatim je linearno smanjen na 2,5% B tijekom 2 minute.Kolona je bila uravnotežena na 2,5% B 8 minuta prije sljedećeg ciklusa.Umreženi peptidi eluirani iz analitičke kolone ionizirani su u izvoru ionizacije nanoelektrospreja (NSI) i ubrizgani u maseni spektrometar Exploris 480 (Thermo Scientific).
Maseni spektrometar Orbitrap Exploris 480 radio je u načinu pozitivne korelacije podataka.Potpuno skeniranje provedeno je u rezoluciji od 120 000 s postavkama raspona od m/z 350 Th do m/z 2000 Th.Normalizirani cilj AGC postavljen je na 300% s maksimalnim ulaznim vremenom od 50 ms.Monoizotopska vršna detekcija uspostavljena je za peptide.Parametar opuštanja ograničenja postavljen je na true ako se pronađe premalo prekursora.Minimalna ionska jakost prekursora postavljena je na 5,0e3, a stanja naboja prekursora do +8 uključena su u eksperimente.
Vrijeme ciklusa između glavnih skeniranja u načinu korelacije podataka postavljeno je na 2,5 sekunde.Dinamičko isključenje mase postavljeno je na 20 s nakon prve fragmentacije iona prekursora.Prozor izolacije prekursora postavljen je na 2 Th.Vrsta normalizirane energije sudara s fiksnim modom energije sudara odabrana je u MS/MS skeniranju ovisnom o podacima.Energija sudara postavljena je na 30%.Rezolucija Orbitrap-a postavljena je na 15 000, a ciljani AGC na 100%.Prilagođeno maksimalno vrijeme ubrizgavanja postavljeno je na 60 milisekundi.
Prije praćenja mreže protein-protein u umreženim uzorcima, obradili smo neobrađene datoteke pomoću paketa MaxQuant (verzija 1.6.12.0)26,27 kako bismo identificirali peptide/proteine ​​koji se mogu pratiti u uzorcima.Osim toga, slične proteomske analize provedene su na neobjavljenim uzorcima FLO-1 tretiranih i neobrađenih s IFNα.MS/MS podaci pretraženi su u UniProt ljudskoj bazi podataka (www.uniprot.org) (uploadana 12. kolovoza 2020., sadrži 75.093 unosa) pomoću ugrađene tražilice Andromeda27.Pretraživanje je provedeno bez naznaka specifičnosti enzima i različitih modifikacija deamidacije (N, Q) i oksidacije (M).Tolerancije mase prekursora postavljene su na 20 ppm, a ioni proizvoda na 0,02 da.Početno i maksimalno odstupanje mase postavljeno je na 10 ppm.Maksimalna masa peptida postavljena je na 4600 Da, a sličnost sekvenci postavljena je između 7 i 25 aminokiselina (AA).Daljnja statistička analiza provedena je korištenjem Perseus programa (verzija 1.6.10.45).Sadržaj proteina izračunat je normalizacijom spektralnog intenziteta proteina (LFQ intenzitet; neoznačena kvantifikacija)27, a vrijednosti intenziteta pretvorene su u Log2.Hijerarhijsko grupiranje proteina identificiranih intenzitetom njihovog peptida izgrađeno je korištenjem PheatMap (v1.0.12) paketa u R (V 4.1.2).Analiza obogaćenja puta provedena je korištenjem Reactome baze podataka puta za proteine ​​tretirane IFNα koji su bili više od četiri puta aktivirani u usporedbi s netretiranim uzorcima.
Identifikacija lizinskih (K) ili serinskih (S) specifičnih kemijskih poprečnih veza proteinskih kompleksa praćenih LC-MS/MS provedena je korištenjem stroja za spektroskopsku identifikaciju (SIM-XL) za poprečno povezane peptide (SIM-XL)29.Prvo, ispitane su moguće interakcije između gena za otpornost na oštećenje DNA (IRDS) povezanih s interferonom (IFN) korištenjem skupa podataka o IRDS proteinima opisanog u Padariya et al.28.Provjera svih stanja i ponavljanja cijelog ljudskog UniProt-a računalno je intenzivna, tako da cijela ljudska UniProt baza podataka (www.uniprot.org) (preuzeta 12. kolovoza 2020., sadrži 75 093 unosa) u odnosu na ponavljanja tretirana IFNα.Jedan od filtara za interakcije visokog povjerenja.Ove dobivene visoko značajne interakcije proširene su i testirane u svim ponavljanjima i uvjetima.
U SIM-XL, DSS je korišten za umreživač (XL), a XL težinski pomak i modifikacijski pomak težine postavljeni su na 138,06 odnosno 156,07.Uzimaju se u obzir sljedeća mjesta reakcije umrežavanja: KK, KS i KN-term, bez reporterskih iona.I prekursor i fragment PPM postavljeni su na 20, a prag Xrea je postavljen na 0,15.Tripsin se smatrao potpuno specifičnim, a provedena je visokoenergetska metoda fragmentacije C-Trap (HCD).XCORR dinamički prag smanjenja DB i minimalni broj peptida za dinamičko smanjenje DB postavljeni su na 2,5 i 2.Ostali parametri su: vjerojatnost monoizotopa i granična vrijednost vršne koincidencije, najmanje 4 AA ostatka po niti i maksimalni naboj niti, te 3 maksimuma propuštenih podjela.Rezultirajuće 2D karte analizirane su u (SIM-XL), a za izgradnju 2D karata korišten je grafički prikaz XQuest28.Proteinski umreženi proteini na proteinskim strukturama nalaze se u PYMOL -u (PYMOL MOLEKULARNI GRAFIČKI SUSTAV, VERSIJA 2.0 SCHRödinger, LLC).
Strukture proteinskih modela izrađene su korištenjem Phyre2 poslužitelja (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 korištenjem načela homološkog modeliranja i implementacije “Skrivene Markovljeve metode”.Phyre2 generira strukture modela na temelju usklađivanja sekvenci s poznatim strukturama proteina.Za H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 i MDN1 proteina, Korištene su strukture predloška 1KX552, 1KJ349, 2EZE55, 6HLU62 i 6I2665.Osim toga, razmatrana je i struktura AlphaFold71 MX1, UBP18 i ROBO1.Struktura proteina vizualizirana je pomoću paketa BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, SAD) i paketa Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).