ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex zavarena cijev za kemijsku industriju kemijska komponenta, nedostatak SPECC1L dovodi do povećane stabilnosti spojenih spojeva i smanjenog odvajanja stanica kranijalnog neuralnog grebena.

Hvala što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, web stranicu prikazujemo bez stilova i JavaScripta.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex zavarena cijev za kemijsku industriju

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.je vodeći proizvođač koji je specijaliziran za bešavne cijevi od nehrđajućeg čelika, svijetlo žarene cijevi, bešavne spiralne cijevi itd.Kako bismo olakšali kupcima, imamo i zavarene cijevi.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ima najnapredniju opremu za proizvodnju i testiranje.Možemo u potpunosti zadovoljiti vaše zahtjeve.Vrlo strogo prema standardu, cijevi koje proizvodimo uvijek imaju točnu OD i WT toleranciju.Kontrola tolerancije je strogo u skladu sa standardima proizvodnje.Našim proizvodima uvijek su zadovoljni kupci.Kupci koji su kupili naše proizvode stvorili su više profita.
a) OD (vanjski promjer): 3,18 mm do 101,6 mm
b) WT (debljina stijenke): 0,5 mm do 20 mm
c) Duljina: Prema zahtjevu kupca
d) Standardi: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 itd
e) Metoda obrade: ERW, EFW itd

Klizači koji prikazuju tri članka po slajdu.Za pomicanje kroz slajdove koristite gumbe Natrag i Sljedeće ili gumbe za upravljanje slajdovima na kraju za kretanje kroz svaki slajd.
Stanice kranijalnog neuralnog grebena (CNCC) odvajaju se od embrionalnih neuralnih nabora i migriraju u faringealne lukove, koji tvore većinu središnjih struktura lica.Disfunkcija CNCC-a igra važnu ulogu u etiologiji orofacijalnog rascjepa, česte kongenitalne malformacije.Heterozigotne mutacije SPECC1L pronađene su u bolesnika s atipičnim i sindromskim rascjepima.Ovdje izvješćujemo o pojačanom bojenju komponenti kanonskog ljepljivog spoja (AJ), β-katenina i E-kadherina u kultiviranim nokdaun stanicama SPECC1L, a elektronske mikrografije pokazuju apikalno-bazalnu difuziju AJ.Kako bismo razumjeli ulogu SPECC1L u kraniofacijalnoj morfogenezi, stvorili smo model miša s nedostatkom Specc1l.Homozigotni mutanti su smrtonosni za embrion i pokazuju poremećeno zatvaranje neuralne cijevi i CNCC laminaciju.Bojenje AJ proteina je povećano u mutiranim neuralnim naborima.Ovaj AJ defekt je u skladu s defektom u CNCC delaminaciji, koji zahtijeva otapanje AJ.Osim toga, Specc11 mutanti imaju smanjenu PI3K-AKT signalizaciju i povećanu apoptozu.In vitro, blaga inhibicija PI3K-AKT signalizacije u stanicama divljeg tipa bila je dovoljna da inducira promjene AJ.Važno je da se promjene AJ izazvane nokdaunom SPECC1L mogu poništiti aktivacijom puta PI3K-AKT.Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da je SPECC1L, kao novi regulator signalizacije PI3K-AKT i biologije AJ, potreban za zatvaranje neuralne cijevi i stratifikaciju CNCC.
Stanice kranijalnog neuralnog grebena (CNCC) lokaliziraju se na dorzalnom neuroektodermu i odvajaju se od neuroepitela neuralnih nabora u razvoju kroz proces koji uključuje epitelno-mezenhimalni prijelaz (EMT)1,2,3.Premigrirajući epitelni CNCC ometaju međustanične spojeve i postaju migrirajući mezenhimalni CNCC koji ispunjavaju prvi i drugi faringealni luk i tvore većinu kraniofacijalne hrskavice.Stoga su geni koji reguliraju funkciju CNCC-a često poremećeni u etiologiji kraniofacijalnih kongenitalnih anomalija kao što su orofacijalni rascjepi, koji najčešće pogađaju 1/800 rođenih samo u SAD-u.Jedan od kongenitalnih deformiteta8.
Delaminacija CNCC-a podudara se sa zatvaranjem prednje neuralne cijevi između 8,5 i 9,5 dana embrionalnog razvoja u miševa.Mutanti brojnih gena mišjih orofacijalnih rascjepa također pokazuju neki oblik defekta neuralne cijevi, uključujući Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 i Pdgfrα12.Međutim, procesi zatvaranja neuralne cijevi i stratifikacije CNCC-a mogu se smatrati neovisnima, budući da Splotch mutant miš (Pax3) pokazuje nedostatke u zatvaranju neuralne cijevi bez ikakvog učinka na stratifikaciju ili migraciju CNCC-a 13,14.Dodatni mišji modeli s nedostacima u CNCC disekciji i zatvaranju neuralne cijevi pomoći će u ocrtavanju zajedničke molekularne osnove ova dva procesa.
Izolacija CNCC iz neuroepitelnih stanica zahtijeva otapanje adhezivnih spojeva (AJs), koji se sastoje od proteinskih kompleksa koji sadrže, između ostalog, E-kadherin, β-katenin, α-E-katenin i α-aktinin povezan s aktin filamentima 2 Studije prekomjerne ekspresije E-kadherina u neuralnim naborima pokazale su smanjenje ili odgodu delaminacije CNCC.Nasuprot tome, supresija E-kadherina rezultira ranom stratifikacijom15,16.Mnogi čimbenici koji posreduju u EMT tijekom stratifikacije CNCC su faktori transkripcije (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) i proteini za remodeliranje izvanstaničnog matriksa (ECM) kao što su matrične metaloproteinaze (MMP), međutim CNCC su izravni citoskeletni AJ regulatori još nije poznato.Poznato je da put PI3K-AKT antagonizira razine E-kadherina, uglavnom iz istraživanja raka17.Nedavne studije pokazale su da gubitak PI3K-AKT signalizacije temeljene na PDGFα kod miševa dovodi do kraniofacijalnih abnormalnosti, uključujući rascjep nepca i defekte neuralne cijevi12.Međutim, odnos između puta PI3K-AKT i stabilnosti AJ nakon stratifikacije CNCC nije jasan.
Prethodno smo identificirali SPECC1L kao prvi mutirani gen kod dvoje ljudi s teškim rascjepom koji se proteže od usta do oka, poznatim kao kosi rascjep (ObFC) ili Tessier IV18 rascjep.Mutacije SPECC1L identificirane su u dvije višegeneracijske obitelji s autosomno dominantnim sindromom Opitz G/BBB (OMIM #145410), u kojima su zahvaćene osobe pokazale hiperdistanciju i rascjep usne/nepca19, te u jednoj obitelji sa sindromom prekomjerne udaljenosti Tibi (OMIM #145420)20 .više od polovice slučajeva Opitz G/BBB sindroma je X-vezano (OMIM #300000) i uzrokovano je mutacijama u MID1 genu, koji kodira protein 22 staničnog kostura povezanog s mikrotubulama.Pretpostavljamo da SPECC1L, također protein povezan s mikrotubulama i aktinskim citoskeletom, može posredovati u signalizaciji potrebnoj za remodeliranje aktinskog citoskeleta tijekom stanične adhezije i migracije 18 .Kroz in vitro i in vivo studije, sada opisujemo SPECC1L kao novi regulator stabilnosti AJ putem PI3K-AKT signalizacije.Na staničnoj razini, nedostatak SPECC1L rezultirao je smanjenjem razine pan-AKT proteina i povećanjem apikalno-bazalne disperzije AJ, što je eliminirano kemijskom aktivacijom AKT puta.In vivo, embriji s nedostatkom Specc11 pokazuju poremećeno zatvaranje neuralne cijevi i smanjenu disekciju CNCC-a.Dakle, SPECC1L funkcionira u visoko reguliranoj signalizaciji temeljenoj na staničnoj adheziji potrebnoj za normalnu funkciju CNCC tijekom morfogeneze lica.
Kako bismo okarakterizirali ulogu SPECC1L na staničnoj razini, koristili smo prethodno opisanu stabilnu staničnu liniju osteosarkoma U2OS s manjkom SPECC1L18.Ove stabilne U2OS stanice s nokdaunom SPECC1L (kd) imale su umjereno (60-70%) smanjenje razina SPECC1L transkripata i proteina, zajedno s nedostacima u migraciji i reorganizaciji aktinskog citoskeleta 18. Nasuprot tome, ozbiljno prolazno smanjenje u Pokazalo se da SPECC1L dovodi do mitotskih defekata 23 .Nakon daljnje karakterizacije, otkrili smo da su naše stabilne SPECC1L-kd stanice promijenile morfologiju pri vrlo visokom stupnju konfluencije (Slika 1).Pojedinačne kontrolne stanice i kd stanice s niskom konfluencijom izgledale su slično (Slika 1A, D).24 sata nakon fuzije, kontrolne stanice zadržale su svoj kockasti oblik (Slika 1B, E), dok su se stanice SPECC1L-kd izdužile (Slika 1C, F).Opseg ove promjene u obliku stanica zabilježen je in vivo živim snimanjem kontrolnih stanica i kd stanica (film 1).Kako bismo odredili ulogu SPECC1L u konfluentnim stanicama, prvo smo ispitali njegovu ekspresiju.Otkrili smo da su se razine SPECC1L proteina povećale nakon spajanja (Slika 1G), dok se razine SPECC1L prijepisa nisu povećale (Slika 1H).Osim toga, kako se gustoća stanica povećavala, protein SPECC1L nakupljao se na međustaničnim granicama (Slika 2A-E), s uzorkom koji se preklapa s uzorkom β-katenina povezanog s membranom (Slika 2A'-E').S obzirom na povezanost SPECC1L s aktinskim citoskeletom 18,23 pretpostavili smo da SPECC1L stupa u interakciju s ljepljivim spojevima (AJ) temeljenim na aktinu.
(AF) SPECC1L knockdown (DF) stanice izdužuju se pri visokoj konfluenciji (F) u usporedbi s kontrolnim U2OS stanicama (AC).Ovdje su prikazane tri od šest vremenskih točaka (T1, T3, T6) koje smo odabrali za različite gustoće stanica.(G) Western blot analiza koja pokazuje da je protein SPECC1L stabiliziran na visokom stupnju konfluencije u usporedbi s niskim stupnjem konfluencije u kontrolnim stanicama.Western blot SPECC1L pokazuje očekivanu vrpcu od 120 kDa i vrpcu veće molekularne težine, vjerojatno post-translacijsko modificiranu (*).Western blot analiza provedena je pod istim uvjetima za nisku i visoku konfluenciju.Slike koje prikazuju SPECC1L pri niskoj i visokoj konfluenciji uzete su iz iste mrlje.Ista mrlja je uklonjena i ponovno ispitana s β-aktin antitijelom.(H) Kvantitativna RT-PCR analiza nije pokazala značajne promjene u razinama prijepisa SPECC1L.Trake pogrešaka predstavljaju SEM iz četiri neovisna eksperimenta.
(AE) Odabrali smo šest vremenskih točaka (T1-T6) koje predstavljaju raspon gustoće stanica kako bismo normalizirali analizu oblika stanice i promjene AJ u U2OS stanicama s SPECC1L nokdaunom (kd).Prvih pet od ovih vremenskih točaka uključivalo je pojedinačne stanice (T1), 50-70% fuziju klastera malih stanica (T2), fuziju bez preoblikovanja kd stanica (T3), preoblikovanje kd stanica (T4) i 24-satne promjene.u stražnjem obliku kd (T5) stanica.Protein SPECC1L bio je pretežno raspršen u citoplazmi u T1 (A), ali je njegovo nakupljanje primijećeno na međustaničnim granicama u kasnijim vremenskim točkama (B–E, strelice).(FJ) β-katenin pokazuje slično nakupljanje na međustaničnim granicama povezanim s AJ kompleksom.(A'-E') SPECC1L i β-katenin pokazuju preklapajuće bojenje na granicama stanica pri visokoj gustoći stanica (strelice).(F'-J') U SPECC1L-kd stanicama, bojanje β-katenina izgleda normalno pri niskoj gustoći stanica (F'-H'), ali se širi kako se mijenja oblik stanice (I', J'; strelice), što ukazuje da AJ su se promijenili.Šipke = 10 µm.
Zatim smo pokušali odrediti učinak nedostatka SPECC1L na AJ.Koristili smo nekoliko markera povezanih s AJ, uključujući kanonske komponente F-aktin, miozin IIb, β-katenin i E-kadherin24,25,26,27.Aktinska stresna vlakna su se povećala u SPECC1L-kd stanicama kao što je prethodno opisano (Sl. 3A,B) 18 .Miozin IIb povezan s aktin filamentima pokazao je sličan porast SPECC1L-kd stanica in vitro (Slika 3C,D).β-katenin povezan s AJ-om veže se za kadherin na staničnoj membrani, pokazujući normalan uzorak ekspresije "saća" u kontrolnim kubocitima (Slika 3E,G).Zanimljivo je da je na ravnim slikama upotrebom konfokalne mikroskopije bojanje β-kateninom (Slika 3E,F) i E-kadherinom (Slika 3G,H) na staničnoj membrani konfluentnih stanica s nedostatkom SPECC1L pokazalo istaknute uzorke produljenog bojenja.Ovo širenje bojenja β-katenina povezanog s AJ u kd stanicama bilo je najizraženije pri konfluenciji, ali se činilo da prethodi promjenama u obliku stanice (Sl. 2F-J, F'-J').Kako bismo odredili fizičku prirodu ovog proširenog AJ bojenja, ispitali smo granice stanica na apikalno-baznoj površini stanica SPECC1L-kd U2OS transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM) (Slika 3I,J).Za razliku od kontrolnih stanica (Sl. 3I), koje su imale odvojena područja gustoće elektrona koja su indikativna za AJ (strelice), kd stanice (Sl. 3J) pokazale su velika, susjedna područja visoke gustoće elektrona što je indikativno za AJ duž apikobazalne ravnine..Osim toga, na poprečnim presjecima uočili smo opsežne nabore stanične membrane u kd stanicama (Sl. S1A, B), što objašnjava prošireni uzorak vrpci bojenja β-katenina i E-kadherina (Sl. 3F, H).U prilog ulozi SPECC1L u AJs, β-katenin je ko-imunoprecipitiran sa SPECC1L u lizatima konfluentnih U2OS stanica (slika 3K).Zajedno s produženim imunobojanjem za AJ markere, TEM analiza bila je u skladu s našom hipotezom da nedostatak SPECC1L povećava apikalno-bazalnu gustoću i varijancu AJ.
(AH) Povećano bojanje F-aktina u kd stanicama 48 sati nakon fuzije (T6; A, B).Promijenjeno bojenje miozina IIb povezano s F-aktinom (C, D).Glatki uzorak bojenja membrane β-katenina i E-kadherina u kontrolnim stanicama (E, G) poboljšan je u stanicama SPECC1L-kd (F, H).Šipke = 10 µm.(I–J) Elektronske mikrografije koje promatraju apikalno-bazalni međustanični spoj.Kontrolne stanice pokazuju jasna područja gusta elektrona koja ukazuju na ljepljive spojeve (I, strelice).Nasuprot tome, cijeli apikalno-bazalni spoj u stanicama SPECC1L-kd činio se elektronski gustim (J, strelice), što ukazuje na povećanu gustoću i disperziju ljepljivih spojeva.(K) β-katenin je ko-imunoprecipitiran sa SPECC1L u konfluentnim lizatima stanica U2OS.Slika snimljena s jednog mjesta predstavlja jedan od četiri neovisna eksperimenta.
Kako bismo razumjeli ulogu SPECC1L u kraniofacijalnoj morfogenezi, stvorili smo model miša s nedostatkom Specc1l koristeći dvije neovisne stanične linije ES trap, DTM096 i RRH048 (BayGenomics, CA), koje predstavljaju intron 1, a transkripti Specc1l snimljeni su na 15 (Slika 1) .4A, slika S2).Genomska lokacija umetka vektora mamca određena je sekvenciranjem cijelog genoma i potvrđena PCR-om (Sl. S2).Oba dizajna genske zamke također su omogućila fuziju Specc11-lacZ reportera nakon snimanja u okviru.Stoga je ekspresija lacZ određena X-gal bojenjem korištena kao pokazatelj ekspresije Specc11.Oba su alela pokazala slične obrasce ekspresije lacZ, s DTM096 genskom zamkom u intronu 1 koja pokazuje jaču ekspresiju od RRH048 u intronu 15 (nije prikazano).Međutim, Specc1l je široko ekspresiran, s posebno snažnom ekspresijom u neuralnim naborima na E8.5 (Slika 4B), u neuralnoj cijevi i facijalnim procesima na E9.5 i E10.5 (Slika 4C,D), te u udovima u razvoju na E10.5 i oči (slika 4D).Prethodno smo izvijestili da je ekspresija SPECC1L u prvom faringealnom luku na E10.5 bila prisutna u epitelu i ispod mezenhima18, u skladu s linijom CNCC.Kako bismo testirali ekspresiju SPECC1L u CNCC, izveli smo E8.5 neuralne nabore (Slika 4E-J) i E9.5 presjeke lubanje (Slika 4K-).Na E8.5, SPECC1L je intenzivno obojio neuralne nabore (Slika 4E, H), uključujući stanice obojene NCC markerima (Slika 4G, J).Na E9.5, SPECC1L (Slika 4K, N) snažno je obojio migrirajući CNCC istovremeno obojen s AP2A (Slika 4L, M) ili SOX10 (Slika 4O, P).
(A) Shematski prikaz mišjeg gena Specc11 koji prikazuje umetanje vektora mamaca u stanične klonove ES DTM096 (intron 1) i RRH048 (intron 15).(BD) lacZ bojenje heterozigotnih Specc1lDTM096 embrija koji predstavljaju ekspresiju Specc1l od E8.5 do E10.5.NE = neuroektoderm, NF = neuralni nabor, PA1 = prvi faringealni luk.(EP) SPECC1L imunološko bojenje s NCC markerima AP2A i SOX10 u E8.5 (NF; EJ) neuralnim naborima i E9.5 (KP) dijelovima lubanje.Bojenje SPECC1L široko je uočeno u neuralnim naborima E8.5 (E, H; vrhovi strelica), uključujući stanice označene s AP2A (F, G; vrhovi strelica) i SOX10 (I, J; vrhovi strelica).Na E9.5, SPECC1L snažno je obojio migrirajuće CNCC (K, N; strelice) označene AP2A (L, M; strelice) i SOX10 (O, P; strelice).
Križanje između heterozigotnih Specc1lDTM096/+ i Specc1lRRH048/+ miševa pokazuje da dva alela zamke gena nisu komplementarna i da su složeni heterozigoti i embrionalni homozigoti za bilo koji alel zamke gena smrtonosni za embrion (Tablica S1).Mendelski omjeri ukazuju na smanjenje stope preživljavanja heterozigota pri rođenju (očekivano 1,34 naspram 2,0).Primijetili smo nisku perinatalnu smrtnost među heterozigotima, neki su imali kraniofacijalne anomalije (slika S3).Međutim, niska penetracija ovih perinatalnih kraniofacijalnih fenotipova otežava proučavanje njihovih temeljnih patofizioloških mehanizama.Stoga smo se usredotočili na embrionalni letalni fenotip homozigotnih Specc11 mutanata.
Većina složenih heterozigotnih ili homozigotnih Specc1lDTM096/RRH048 mutantnih embrija nije se razvila nakon E9.5-10.5 (slike 5A-D), a neuralna cijev se nije zatvorila sprijeda (slike 5B, D), a ponekad se zatvorila straga (nije prikazano) ..Ovaj defekt zatvaranja lubanjske neuralne cijevi bio je povezan s većinom CNCC označenog DLX2 koji je ostao u neuralnim naborima na E10.5, što ukazuje da nema disekcije (Slika 5A'-D').Kako bismo utvrdili je li ukupna veličina CNCC također smanjena, označili smo CNCC linije s GFP u našim linijama zamke gena s Wnt1-Cre i ROSAmTmG.Prenosimo sortirane GFP+ NCC i GFP- (RFP+) ne-NCC iz cijelih embrija.Na E9.5, udio protokom sortiranih GFP-označenih CNCC nije se značajno promijenio između WT i mutantnih embrija (nije prikazano), što ukazuje na normalnu specifikaciju CNCC.Stoga smo pretpostavili da je zaostalo bojenje Wnt1-Cre i DLX2 u izloženim neuralnim naborima (Slika 5B') posljedica neispravnog slojevanja CNCC, vjerojatno zbog povećane gustoće ili disperzije AJ stanica, kao što se vidi u stanicama SPECC1L-kd.Koristili smo NCC markere SOX10, AP2A i DLX2 da potvrdimo prisutnost CNCC u neuralnom naboru (Slika 5E-R).Na E8.5, bojanje neuralnog nabora za sva tri NCC markera uočeno je u dijelovima WT (Slika 5E, G, I) i Specc1l mutanta (Slika 5F, H, J).Na E9.5, dok su NCC markeri bojili migrirajući NCC u WT presjecima (Slika 5M, O, Q), zaostalo NCC bojenje primijećeno je u izloženim neuralnim naborima Specc1l mutantnih embrija (Slika 5N, P, R).Budući da SOX10 i DLX2 označavaju migrirajuće CNCC, ovaj rezultat sugerira da CNCC s nedostatkom SPECC1L postižu postmigracijske specifikacije, ali ne uspijevaju migrirati iz neuralnih nabora.
Nedostatak Specc11 dovodi do neispravnog zatvaranja neuralne cijevi, delaminacije stanica kranijalnog neuralnog grebena i AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrij koji nosi migrirajuće stanice kranijalnog neuralnog grebena (CNCC) označene s Wnt1-Cre (A').Nasuprot tome, mutirani embriji Specc11 pokazuju otvorene neuralne nabore (B), vrhovi strelica) i CNCC koji nisu migrirali (B', vrhovi strelica).(C, D') Slike svijetlog polja (C, D') i imunološko bojenje (C', D') CNCC markera DLX2 E10.5 WT embrija (C, C') i Specc1l (D, D').U WT E10.5 embrija, DLX2-pozitivan CNCC kolonizira škržne lukove (C', strelice), dok u mutanata vidljivo obojenje ostaje u otvorenim neuralnim naborima (D', strelice) i u prvim lukovima ždrijela (D', strelice).) s nekim bojama (strelice) koje ukazuju na lošu delaminaciju i migraciju CNCC.ER) Sekcije WT i Specc1l mutantnih embrija u stadijima E8.5 (E–L) i E9.5 (M–R) obilježene su NCC markerima SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) i DLX2 (I, J, Q, R).Na E8.5, NCC bojenje je primijećeno u neuralnim naborima divljeg tipa (NF) i mutantnim sekcijama.Zajedničko bojenje SOX10 i β-katenina u E8.5 WT (K) i mutantu (L) otkrilo je povećano bojenje β-katenina na granicama stanica u neuralnim naborima.Na E9.5 primijećeno je bojanje divljeg tipa migrirajućih CNCC (M, O, Q), dok su kod mutanata nestratificirani CNCC obojili otvorene neuralne nabore (N, P, R).(S–Z) In vivo analiza AJ označavanja u koronalnim presjecima embrija WT i Specc11DTM096/RRH048 s mutacijom E9.5.U gornjem desnom kutu prikazana je približna presječna ravnina.U presjecima mutiranih tkiva uočeno je pojačano bojenje F-aktina (S, T) i miozina IIb (U, V).Slično rezultatima in vitro na slici 3, u mutantnih embrija uočeno je pojačano bojenje membrane za β-katenin (W, X) i E-kadherin (Y, Z).(AA-BB) Elektronska mikrografija presjeka embrija divljeg tipa koji gleda izvan granice apikalno-bazalne stanice pokazuje jasno područje gustoće elektrona koje ukazuje na adhezivne spojeve (AA, strelice).Nasuprot tome, u dijelovima Specc11 mutantnih embrija (BB, strelice), cijeli apikobazalni spoj je gust elektrona, što ukazuje na povećanu gustoću i disperziju adhezivnih spojeva.
Kako bismo testirali našu hipotezu da je smanjeno raslojavanje posljedica promijenjenog AJ, ispitali smo označavanje AJ u izloženim neuralnim naborima Specc1l mutantnih embrija (Sl. 5S-Z).Uočili smo povećanje aktinskih stresnih vlakana (Slika 5S, T) i popratnu povećanu lokalizaciju bojenja miozina IIB na aktinskim vlaknima (Slika 5U, V).Važno je da smo primijetili pojačano bojenje β-katenina (Slika 5W,X) i E-kadherina (Slika 5Y,Z) na međustaničnim granicama.Također smo ispitali bojenje NCC-a β-kateninom u neuralnim naborima embrija E8.5 (Sl. 5K, L).Čini se da je bojanje β-kateninom jače u Specc1l mutantnim neuralnim naborima (Sl. 5L i K), što sugerira da su počele promjene AJ.Na elektronskim mikrofotografijama dijelova lubanje embrija E9.5 ponovno smo primijetili povećano difuzno bojenje gustim elektronima u Specc1l mutantnim embrijima u usporedbi s WT (Sl. 5AA, BB i S1E-H).Uzeti zajedno, ovi rezultati podupiru naše in vitro rezultate u SPECC1L-kd U2OS stanicama i sugeriraju da aberantno AJ bojenje prethodi CNCC stratifikaciji u našim mutiranim embrijima.
S obzirom na poznati antagonistički odnos između AKT aktivnosti i stabilnosti E-kadherina,17,28 pretpostavili smo uključenost PI3K-AKT signalizacije.Osim toga, primijetili smo subepidermalne mjehuriće u nekim od naših mutantnih embrija koji su izbjegli smrtnost (<5%) na E9,5-10,5 i umjesto toga su se smjestili na oko E13,5 (Slika S3).Subepidermalne vezikule su obilježje smanjene PI3K-AKT signalizacije temeljene na PDGFRα12.Fantauzzo i sur.(2014.) izvijestili su da poremećaj aktivacije PI3K temeljene na PDGFRα u mutiranim embrijima PdgfraPI3K/PI3K rezultira subepidermalnim vezikulama, defektima neuralne cijevi i fenotipovima rascjepa nepca.Doista, razine pan-AKT i aktivnog fosforiliranog Ser473-AKT smanjene su in vivo u Speccll mutantnim tkivima do E9.5 embrionalnog zastoja (Slika 6A-D).Smanjenje razina fosforiliranog Ser473-AKT može biti u potpunosti posljedica smanjenja razina pan-AKT in vivo (Slika 6E) i in vitro (Slika 6F).Smanjenje in vitro primijećeno je samo kada su U2OS stanice bile snažno konfluentne s promjenama u obliku stanice i gustoći AJ (Slika 6D).Stoga naši podaci sugeriraju da je SPECC1L novi pozitivni regulator signalizacije PI3K-AKT u kraniofacijalnoj morfogenezi.
(A–E) E8.5 (A,B) i E9.5 (C,D) presjeci lubanje ili E9.5 lizati iz Specc1l mutantnih embrija (E) koji pokazuju razine aktivnog fosforiliranog S473-AKT i smanjenja pan-AKT proteina , u usporedbi s kontrolnim WT.Western blot je izveden na lizatima divljeg tipa i mutantnim lizatima pod istim uvjetima.Prikazane slike za SPECC1L uzete su iz jedne mrlje.Ista mrlja je uklonjena i ponovno ispitana s anti-pan-ACT i β-aktin antitijelima.Razine Pan-AKT u E8.5 neuralnim naborima (A, B) i razine fosforiliranog S473-AKT u E9.5 dijelovima lubanje bile su značajno smanjene.(F) Razine Pan-AKT bile su slično smanjene u lizatima SPECC1L-kd U2OS stanica sakupljenih pri visokoj konfluenciji.Trake pogrešaka predstavljaju SEM iz tri neovisne Western blot kvantifikacije.(GJ) Sekcije WT embrija na E9.5 obojene KI67 odnosno cijepanom kaspazom 3, pokazujući staničnu proliferaciju (G, G') i malu apoptotičku aktivnost (H, H').Specc11 mutirani embriji pokazuju usporedivu staničnu proliferaciju (I), ali je broj stanica koje prolaze kroz apoptozu značajno povećan (J).
Zatim smo ispitali markere proliferacije i apoptoze.Nismo uočili nikakvu razliku u proliferaciji embrija E9.5 (Slika 6E, G u usporedbi s I) s indeksom proliferacije od 82,5% za WT mutante i 86,5% za Specc1l mutante mjereno bojanjem KI67 (p <0,56, Fisherov točan test).Slično tome, nismo uočili nikakvu razliku u apoptozi mjerenoj bojenjem za rascijepljenu kaspazu 3 u neuralnim naborima na E8.5 do zaustavljanja embrija (nije prikazano) (nije prikazano).Nasuprot tome, apoptoza je značajno povećana u svih E9.5 mutiranih embrija (Slika 6F, H i J).Ovo ukupno povećanje apoptoze u skladu je sa smanjenom signalizacijom PI3K-AKT i ranom embrionalnom letalitetom29,30,31.
Zatim, kako bismo potvrdili uzročnu ulogu PI3K-AKT signalizacije u promjenama AJ u našim kd stanicama, kemijski smo promijenili put u kontrolnim i kd stanicama (Slika 7A-F).Kao marker koristili smo fenotip promjene oblika stanice opažen u konfluentnim stanicama SPECC1L-kd, koje smo kvantificirali korištenjem omjera najduže dimenzije (dužine) prema odgovarajućoj okomitoj dimenziji (širini).Očekuje se omjer 1 za relativno okrugle ili kockaste ćelije (Slika 7G).Osim oblika stanice, također smo potvrdili učinak na AJ bojenjem β-kateninom (Sl. 7A'-F').Inhibicija puta PI3K-AKT korištenjem wortmanina bila je dovoljna za promjenu oblika stanica u kontrolnim stanicama (Slika 7A,C) i AJ (Slika 7A').PI3K-AKT aktivator SC-79 nije utjecao na oblik stanice (SLIKA 7A, E) ili ekspanziju AJ (SLIKA 7A') u kontrolnim stanicama.U SPECC1L-kd stanicama, daljnja supresija puta PI3K-AKT rezultirala je povećanom apoptozom (Slika 7B,D) i izraženim povećanjem bojenja β-katenina (Slika 7B'), u skladu s našim in vivo teškim mutantima.Važno je da je aktivacija puta PI3K-AKT značajno poboljšala oblik stanice (Slika 7B, F) i fenotipove AJ (Slika 7B”).Promjene u obliku stanice kvantificirane su kao omjer zaobljenosti stanice (CCR) i uspoređivane na značaj kao što je gore opisano (Slika 7G).Doista, u kontrolnim stanicama (Slika 7G, CCR = 1,56), tretman wortmaninom bio je dovoljan da značajno promijeni oblik stanice (Slika 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) u mjeri sličnoj opaženoj u SPECC1L.-kd stanica (slika 7G, CCR = 3,46).Tretman SPECC1L-kd stanica wortmaninom (Slika 7G, CCR = 3,60, zanemarivo) nije bio značajniji od netretiranih kd stanica (Slika 7G, CCR = 3,46, zanemarivo) ili kontrolnih stanica tretiranih wortmaninom (Slika 7G)., CCR = 3,46, zanemarivo) dodatno utječe na produljenje stanice (7G, CCR = 3,61, zanemarivo).Najvažnije je da je aktivator SC-79 AKT obnovio izduženi fenotip stanica SPECC1L-kd (Slika 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Ovi rezultati potvrđuju da SPECC1L regulira signalizaciju PI3K-AKT i sugeriraju da umjereno smanjenje SPECC1L utječe na staničnu adheziju, dok snažno smanjenje dovodi do apoptoze (slika 8).
(A–F') Kontrolne (A, C, E) i SPECC1L-kd (B, D, F) stanice tretirane inhibitorom puta PI3K-AKT wortmaninom (C, D) ili SC-79 aktivatorom (E, F) Liječenje Netretirane kontrolne stanice su kuboidne (A) s normalnim β-cat staničnim bojanjem (A'), dok su kd stanice izdužene (B) s pojačanim β-cat obojenjem (B').Nakon supresije puta PI3K-AKT, kontrolne su se stanice izdužile (C) s ekspanzijom β-cat (C'), dok su kd stanice počele prolaziti kroz apoptozu (D), slično našim visoko mutiranim embrijima i pokazujući iznimno pojačan β-cat.bojenje (D').Nakon aktivacije puta PI3K-AKT, kontrolne stanice ostale su kuboidne (E) i imale su normalno β-cat (E') obojenje, dok su kd stanice pokazale značajno poboljšan oblik stanice (F) i β-cat (F') bojenje, što ukazuje na (G) Stupanj promjene oblika stanice u (AF) kvantificiran je korištenjem omjera zaobljenosti stanice (CCR) najduže dimenzije (dužine) i odgovarajuće vertikalne dimenzije (širine) pomoću softvera MetaMorph.Netretirane (NT) stanice SPECC1L-kd (CCR = 3,46) bile su značajno dulje od kontrolnih stanica (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Wortova inhibicija puta PI3K-AKT u kontrolnim stanicama bila je dovoljna da izazove slično produljenje oblika stanice (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Slično, aktivacija AKT pomoću SC-79 u SPECC1L-kd stanicama vratila je staničnu elongaciju na kontrolne razine (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10–12).Liječenje SPECC1L-kd stanica wortmaninom rezultiralo je povećanom apoptozom, ali bez daljnjeg povećanja promjene oblika stanice (CCR=3,60) u usporedbi s netretiranim kd (CCR=3,46, ns) ili kontrolnim stanicama tretiranim wortmaninom (3,61) opaženim u .ns = nije bitno.Prikazana su +/- SEM mjerenja za 50 stanica.Statističke razlike izračunate su Studentovim t-testom.
(A) Shematski prikaz inhibicije i aktivacije puta PI3K-AKT što rezultira promjenama AJ, odnosno spašavanjem.(B) Predloženi model za stabilizaciju AKT proteina pomoću SPECC1L.
Premigracijski CNCC zahtijevaju lizu AJ da bi se odvojio od neuroepitelnih stanica prednjeg neuralnog nabora1,15,32.Povećano bojenje komponenata AJ i gubitak apikalno-bazalne asimetrične distribucije AJ u stanicama s nedostatkom SPECC1L i in vitro i in vivo, u kombinaciji s fizičkom blizinom SPECC1L β-kateninu, sugerira da SPECC1L funkcionira tako da pravilno održava lokalnu stabilnost AJ za organizacijski mišići.aktinski citoskelet.Povezanost SPECC1L s aktinskim citoskeletom i β-kateninom i povećanjem broja kondenziranih aktinskih filamenata u odsutnosti SPECC1L u skladu je s opaženim povećanjem gustoće AJ.Druga je mogućnost da povećan broj aktinskih vlakana u stanicama s nedostatkom SPECC1L dovodi do promjene međustanične napetosti.Budući da stanični stres utječe na dinamiku AJ 33, promjene napona mogu rezultirati difuznijim AJ 34 .Dakle, sve promjene će utjecati na CNCC slojeve.
Wnt1 se eksprimira u ranim neuralnim naborima koji stvaraju stanice neuralnog grebena.Stoga, praćenje loze Wnt1-cre označava i NCC35 prije i migraciju.Međutim, Wnt1 također označava klonove dorzalnog moždanog tkiva također izvedene iz ranih neuralnih nabora 35,36, što čini vjerojatnim da naše bojenje E9.5 mutanata za Wnt1 markere u otvorenim neuralnim naborima nije CNCC.Naše pozitivno bojenje za NCC markere AP2A i SOX10 potvrdilo je da su izloženi neuralni nabori Specc11 mutantnih embrija doista sadržavali CNCC.Nadalje, budući da su AP2A i SOX10 markeri ranog migrirajućeg NCC-a, pozitivno bojenje je pokazalo da su te stanice post-migracijski CNCC koje se ne mogu stratificirati prema E9.5.
Naši podaci sugeriraju da je molekularna regulacija AJ pomoću SPECC1L posredovana PI3K-AKT signalizacijom.AKT signalizacija je smanjena u stanicama i tkivima s nedostatkom SPECC1L.Nalazi Fantauzza i sur.podržavaju izravnu ulogu PI3K-AKT signalizacije u kraniofacijalnoj morfogenezi.(2014.) pokazali su da nedostatak aktivacije PI3K-AKT signalizacije koja se temelji na PDGFRα dovodi do fenotipa rascjepa nepca.Također pokazujemo da je inhibicija PI3K-AKT puta dovoljna za promjenu AJ i oblika stanica u U2OS stanicama.U skladu s našim nalazima, Cain et al.37 pokazalo je da smanjenje podjedinice PI3K α110 u endotelnim stanicama rezultira sličnim povećanjem bojenja pericelularnog β-katenina, što se naziva povećanjem "indeksa povezanosti".Međutim, u endotelnim stanicama čiji su aktinski filamenti već visoko organizirani, supresija puta PI3K-AKT rezultira labavim staničnim oblikom.Nasuprot tome, stanice SPECC1L-kd U2OS pokazale su izduženi oblik stanice.Ova razlika može biti specifična za vrstu stanice.Dok supresija PI3K-AKT signalizacije trajno utječe na aktinski citoskelet, učinak na oblik stanice određen je promjenama u napetosti uzrokovanim promjenama u gustoći i organizaciji središnjih aktinskih vlakana.U stanicama U2OS koristili smo samo promjene oblika stanica kao marker promjene i oporavka AJ s nedostatkom SPECC1L.Zaključno, pretpostavljamo da inhibicija AKT puta kod nedostatka SPECC1L povećava stabilnost AJ i smanjuje delaminaciju u CNCC.
Zanimljivo je da su razine pan-AKT smanjene in vitro i in vivo uz fosforilirane razine 473-AKT u odsutnosti SPECC1L, što sugerira regulaciju PI3K-AKT signalizacije na razini stabilnosti ili prometa AKT proteina.Geni SPECC1L i MID1, oba povezani s Opitz/GBBB sindromom, kodiraju proteine ​​koji stabiliziraju mikrotubule 18,22.Mehanizam kojim SPECC1L i MID1 posreduju u stabilizaciji mikrotubula nije u potpunosti shvaćen.U slučaju SPECC1L, ova stabilizacija uključuje pojačanu acetilaciju podskupa mikrotubula 18 .Moguće je da SPECC1L koristi sličan mehanizam za stabilizaciju drugih proteina kao što je AKT.Pokazalo se da acetilacija lizinskih ostataka u AKT proteinu dovodi do smanjenja lokalizacije membrane i fosforilacije38.Dodatno, ubikvitinacija K63 lanca na istom lizinskom ostatku na AKT potrebna je za njegovu membransku lokalizaciju i aktivaciju39,40.Među nekoliko čimbenika koji su u interakciji s proteinima SPECC1L identificiranim u različitim dvohibridnim ispitivanjima kvasca visoke propusnosti, četiri su – CCDC841, ECM2942, APC i UBE2I43 – uključeni u promet ili stabilnost proteina putem ubikvitinacije ili sumoilacije.SPECC1L može biti uključen u post-translacijsku modifikaciju AKT lizinskih ostataka, utječući na stabilnost AKT-a.Međutim, ključnu ulogu SPECC1L u lokalizaciji i stabilnosti AKT proteina tek treba razjasniti.
Teški nedostaci u ekspresiji SPECC1L in vivo rezultirali su povećanim bojenjem AJ markera i neispravnim prekrivanjem CNCC, kao i povećanom apoptozom i ranom embrionalnom letalitetom.Prethodna izvješća su pokazala da su mišji mutanti s povećanom razinom apoptoze povezani s defektima neuralne cijevi 44,45,46,47 i kraniofacijalnim defektima48.Pretpostavlja se da pretjerana stanična smrt u neuralnim naborima ili faringealnim lukovima može rezultirati nedovoljnim brojem stanica potrebnih za pravilno morfogenetsko kretanje 48,49,50.Nasuprot tome, naše stanične linije s manjkom SPECC1L s umjereno smanjenom ekspresijom SPECC1L pokazale su samo AJ promjene bez dokaza povećane stanične smrti.Međutim, kemijska inhibicija puta PI3K-AKT u tim Kd stanicama doista je rezultirala povećanom apoptozom.Stoga, umjereno smanjenje ekspresije ili funkcije SPECC1L osigurava preživljavanje stanice.Ovo je u skladu s opažanjem da rijetki Specc11 mutirani embriji koji izbjegnu uhićenje u St.E9.5 — možda zbog smanjene učinkovitosti hvatanja gena — mogu zatvoriti svoje neuralne cijevi i zaustaviti se kasnije u razvoju, često s kraniofacijalnim defektima (Slika S3).Također je u skladu s tim rijetka pojava heterozigotnih Specc1l embrija s kraniofacijalnim abnormalnostima—vjerojatno zbog povećane učinkovitosti hvatanja gena—kao i nalaz kod zebrica kod kojih jedan od dva SPECC1L ortologa (specc1lb) uzrokuje kasne embrionalne fenotipove, uključujući gubitak donje čeljusti i obostrani rascjepi51.Stoga heterozigotne SPECC1L mutacije gubitka funkcije identificirane kod pacijenata mogu uzrokovati mala oštećenja u funkciji SPECC1L tijekom kraniofacijalne morfogeneze, dovoljna da objasne njihove orofacijalne rascjepe.Regulacija međustaničnih kontakata temeljena na SPECC1L također može igrati ulogu u palatogenezi i spajanju faringealnih lukova.Daljnje studije funkcije SPECC1L pomoći će razjasniti ulogu privremenih međustaničnih kontakata u CNCC tijekom zatvaranja neuralne cijevi u pokretljivosti neuroepitelnih stanica i kraniofacijalnoj morfogenezi.
Kontrola osteosarkoma U2OS i stanice SPECC1L-kd već su opisane (Saadi et al., 2011.).Protutijela protiv SPECC1L također su ranije karakterizirana (Saadi et al., 2011).Anti-β-katenin antitijela (zec; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (miš; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miozin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), MO) ), E-kadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornija), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), cijepana kaspaza 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) i β-aktin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) korišten je kako je opisano..Aktinski filamenti su obojeni Acti-stain rhodamine phalloidinom (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Kontrolne stanice U2OS i stanice SPECC1L-kd uzgajane su u standardnom DMEM s visokim sadržajem glukoze dopunjenom 10% fetalnog goveđeg seruma (Life Technologies, Carlsbad, CA).Za AJ promjene, 2 x 105 stanica je nasađeno na staklo tretirano sa 0,1% svinjske želatine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i promatrane promjene u obliku stanica.Stanice su sakupljene u različitim naznačenim vremenskim točkama: 4 sata nakon nasađivanja (t = 1), 24 sata nakon nasađivanja (t = 2), konfluencija bez promjene oblika stanice (t = 3), promjena oblika stanice (t = 4) , 24 h nakon promjene oblika stanice (t = 5) i 48 h nakon promjene oblika stanice (t = 6) (sl. 1, 2, 3).Kako bi se modulirao put PI3K-AKT, stanice su uzgajane u naznačenim koncentracijama s inhibitorom PI3K-AKT wortmaninom (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ili aktivatorom SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Medij koji je sadržavao kemikalije mijenjao se svakodnevno.
Snimke okvir po kadar napravljene su na živim kontrolnim i KD stanicama u normalnim uvjetima kulture, a slike faznog kontrasta prikupljane su svakih 10 minuta tijekom 7 dana.Slike su dobivene korištenjem računalno kontroliranog Leica DM IRB invertnog mikroskopa opremljenog mehaničkim postoljem i 10 × N-PLAN objektivom spojenim na QImaging Retiga-SRV kameru.Tijekom snimanja stanične su kulture održavane na 37°C u vlažnoj atmosferi s 5% CO2.
Dvije genske zamke ES stanične linije DTM096 i RRH048 iz Regionalnog centra za mutant miševe (UC Davis, CA) korištene su za generiranje Specc11 deficijentnih mišjih linija, označenih Specc1lgtDTM096 i Specc1lgtRRH046.Ukratko, 129/REJ ES stanice su ubrizgane u C57BL6 blastociste.Rezultirajući himerni mužjaci miševa uzgajani su sa ženkama C57BL6 miševa da se identificiraju potomci s agouti bojom dlake.Prisutnost umetaka vektora zamke gena korištena je za identifikaciju heterozigota.Miševi su držani na mješovitoj pozadini 129/REJ;C57BL6.Lokacija mjesta umetanja vektora genetske zamke potvrđena je RT-PCR-om, sekvenciranjem genoma i genetskom komplementacijom (dodatna slika 1).Kako bi se pratila CNCC loza dvostrukih heterozigotnih Specc1lGT miševa, ROSAmTmG (#007576) i Wnt1-Cre (#003829) miševi (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) križani su kako bi se proizveo ROSAmTmG i Wnt1-Cre alel u Specc1l mutantnim embrijima.Svi pokusi na miševima izvedeni su prema protokolima koje je odobrio Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja Medicinskog centra Sveučilišta u Kansasu.
Embriji su fiksirani u (1% formaldehidu, 0,2% glutaraldehidu, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) 60 minuta na sobnoj temperaturi.Nakon fiksacije u otopini za bojenje X-gal (5 mM kalijev ferocijanid, 5 mM kalijev ferocijanid, 2 mM MgCl2, 0,01% natrijev deoksikolat, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Razvijanje mrlja je izvedeno na 37°C .°C unutar 1-6 sati.Embriji su naknadno fiksirani u 4% PFA i vizualizirani.
Za Western blotting, stanice su lizirane u puferu za pasivnu lizu (Promega, Fitchburg, WI) dopunjenom mješavinom inhibitora HALT proteaze (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lizati su obrađeni na 12% poliakrilamid Mini-PROTEAN TGX gotovim gelovima (Bio-Rad, Hercules, CA) i preneseni na Immobilon PVDF membrane (EMD Millipore, Billerica, MA).Membrane su blokirane u 5% mlijeku u PBS-u koji sadrži 0,1% Tween.Antitijela su inkubirana preko noći na 4°C ili jedan sat na sobnoj temperaturi.Za generiranje signala korišten je Femto SuperSignal West ECL reagens (Thermo Scientific, Waltham, MA).Za imunološko bojenje, embriji su fiksirani preko noći u 4% PFA/PBS i kriokonzervirani.Kriosekcije tkiva su blokirane u PBS-u koji je sadržavao 1% normalnog kozjeg seruma (Thermo Scientific, Waltham, MA) i 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i zatim inkubirane na 4°C u inkubatoru tijekom noć.s anti-antitijelima i fluorescentnim sekundarnim antitijelima (1:1000) 1 sat na 4°C.Obojani rezovi stavljeni su u zlatni medij ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) i ravne slike su dobivene pomoću konfokalnog mikroskopa Leica TCS SPE.Svako imunološko bojenje izvedeno je kao tri neovisna eksperimenta na cirosekcijama najmanje dva mutirana embrija.Prikazan je reprezentativan eksperiment.
Stanice su inkubirane u modificiranom RIPA puferu (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glicerol, 2 mM EDTA i inhibitor HALT proteaze (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Ukratko, lizati su prethodno pročišćeni magnetskim zrncima proteina G (Life Technologies, Carlsbad, CA) i zatim inkubirani preko noći na 4°C s anti-SPECC1L ili IgG zrnca proteina G proteina korištena su za ekstrakciju SPECC1L, a Western blotting je izveden korištenjem anti-SPECC1L. -β-katenin antitijelo opisano gore. Prikazani co-IP eksperimenti reprezentativni su za četiri neovisna eksperimenta.
Fiksne kulture stanica ili mišjih embrionalnih tkiva dostavljeni su centru za elektronsku mikroskopiju u Medicinskom centru Sveučilišta u Kansasu.Ukratko, uzorci su umetnuti u smolu EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimerizirani preko noći na 60°C i izrezani na 80 nm korištenjem ultramikrotoma Leica UC7 opremljenog dijamantnom oštricom.Presjeci su vizualizirani korištenjem prijenosnog elektronskog mikroskopa JEOL JEM-1400 opremljenog pištoljem Lab6 od 100 kV.
Kako citirati ovaj članak: Wilson, NR et al.Nedostatak SPECC1L dovodi do povećane stabilnosti spojenih zglobova i smanjene delaminacije stanica kranijalnog neuralnog grebena.znanost.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Indukcija i diferencijacija neuralnog grebena.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006.).
Cordero, DR i sur.Stanice kranijalnog neuralnog grebena u pokretu: njihova uloga u kraniofacijalnom razvoju.Američki časopis za medicinsku genetiku.Dio A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: njen rast i razvoj tijekom 20 godina.Pedijatar.patologija.laboratorija.lijek.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU i Noten MM Proboj u genetici orofacijalnih rascjepa.Trendovi u molekularnoj medicini 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011.).
Minu, M. i Riley, FM Molekularni mehanizmi migracije stanica kranijalnog neuralnog grebena i uzorkovanja tijekom kraniofacijalnog razvoja.Razvoj 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH i Murray, JK Rascjep usne i nepca: razumijevanje genetskih i okolišnih utjecaja.prirodan komentar.Genetika 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR i sur.Abnormalna morfogeneza kože, udova i kraniofacijalne regije kod miševa s nedostatkom interferon-regulirajućeg faktora-6 (Irf6).Nacionalni Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. i sur.Dominantne mutacije u GRHL3 uzrokuju van der Waordov sindrom i ometaju razvoj oralnog periderma.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014.).
Harris, MJ i Juriloff, DM Ažuriraju popis mišjih mutanata s defektima u zatvaranju neuralne cijevi i napreduju prema potpunom genetičkom razumijevanju zatvaranja neuralne cijevi.Ispitivanje urođenih mana.Dio A, Klinička i molekularna teratologija 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010.).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-posredovana PDGFRalpha signalizacija regulira preživljavanje i proliferaciju u razvoju kostura kroz unutarstanični put ovisan o p53.Razvoj gena 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND i Murdoch, JN Raščupani: Odnos konvergentne ekspanzije i zatvaranja neuralne cijevi.Trendovi u neurologiji.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).